酸素分圧勾配および乱流付き混合培養システムによる血管壁細胞の網羅的遺伝子発現解析

従来我々は血管壁の主要細胞を同時に培養する静的混合培養システムを構築した.さらに最近低酸素下LDL負荷によって平滑筋が役割動脈硬化進展に寄与することを明らかにした.そこで,内皮細胞に力学的刺激,平滑筋には酸素勾配刺激,さらに脂質負荷等複数の環境因子を従来の混合培養系に付加しつつ,血管内と同様の刺激を同時に加えて泡沫細胞形成過程をより詳細に解析することを試みた.6-well chemotaxis chamberにウサギ大動脈から初代培養した平滑筋細胞、コラーゲンマトリックス,および内皮細胞を層状に培養する混合培養に,下室側の培養液の酸素分圧を下げる為培養液の貯留槽に1-3%の低酸素にした培地を循環させた.その結果上室側には12-15%の酸素分圧を,平滑筋側の下室培養液は1-3%の酸素分圧を加えることができた.また,内皮細胞面に加わる力学的刺激をシュミレーションソフトによって計算したところ,chamber中心部分から培養液を吸い上げる部分の周辺に渦流の形成を示唆する結果を得た.72時間下室培養液に3mg/mlの終濃度でLDLを添加し,酸素分圧を2%として前処理してから,単球を添加し7日間培養を行った.終了後検体を固定し,HE染色とCD68染色を行いLDL負荷または低酸素培地を下室に使用した検体では内皮下にCD68陽性マクロファージ細胞の蓄積が認められたが,LDL負荷のみ,または低酸素培地のみを使用した検体ではこのような所見が認められなかった.酸素分圧,力学刺激ともに生体内での状況を反映するために,多くの条件の検討がさらに必要であるが,今回の研究によって単球細胞の内皮下集積,分化を再現することができたので,現在これら泡沫細胞の網羅的遺伝子発現解析を実施している.

従来我々は血管壁の主要細胞を同時に培養する静的混合培養システムを構築した.さらに最近低酸素下LDL負荷によって平滑筋が役割動脈硬化進展に寄与することを明らかにした.そこで,内皮細胞に力学的刺激,平滑筋には酸素勾配刺激,さらに脂質負荷等複数の環境因子を従来の混合培養系に付加しつつ,血管内と同様の刺激を同時に加えて泡沫細胞形成過程をより詳細に解析することを試みた.6-well chemotaxis chamberにウサギ大動脈から初代培養した平滑筋細胞、コラーゲンマトリックス,および内皮細胞を層状に培養する混合培養に,下室側の培養液の酸素分圧を下げる為培養液の貯留槽に1-3%の低酸素にした培地を循環させた.その結果上室側には12-15%の酸素分圧を,平滑筋側の下室培養液は1-3%の酸素分圧を加えることができた.また,内皮細胞面に加わる力学的刺激をシュミレーションソフトによって計算したところ,chamber中心部分から培養液を吸い上げる部分の周辺に渦流の形成を示唆する結果を得た.72時間下室培養液に3mg/mlの終濃度でLDLを添加し,酸素分圧を2%として前処理してから,単球を添加し7日間培養を行った.終了後検体を固定し,HE染色とCD68染色を行いLDL負荷または低酸素培地を下室に使用した検体では内皮下にCD68陽性マクロファージ細胞の蓄積が認められたが,LDL負荷のみ,または低酸素培地のみを使用した検体ではこのような所見が認められなかった.酸素分圧,力学刺激ともに生体内での状況を反映するために,多くの条件の検討がさらに必要であるが,今回の研究によって単球細胞の内皮下集積,分化を再現することができたので,現在これら泡沫細胞の網羅的遺伝子発現解析を実施している.