創傷治癒と肥満細胞:ヒトキマーゼの血管内皮細胞や線維芽細胞に及ぼす影響

キマーゼとトリプターゼ添加における血管新生方法 24ウエル上で、ヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞を共培養させたもので、管腔形成に関する観察を行った。クラボウより血管新生キット(KZ-1000)を購入し、キット到着日,その3日後、6日後、8日後の計4回の試薬の添加と血管新生キット専用培地の交換を行った。試薬添加後11日目に一次抗体としてMouse anti human CD31抗体で染色し、二次抗体にGoat anti mouse IgG AlkP Conjugateで反応させ、BCIPで発色、視覚化した。1ウエル内を十時にマークして、4ヶ所を顕微鏡10倍で撮影し、NIHimageにより管腔形成量を管腔面責として求め、スコアリングした。スコアリングは4ヶ所の管腔面積を平均したものである。Positive controlとしてVEGF-A、Negative controlとしてsuramin、ControlとしてMediumを用いた。キマーゼ濃度は0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlで、さらに阻害剤10μgを加えたものと比較した。また、トリプターゼ0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml添加したものでも検討を行った。結果 キマーゼ添加に関しては血管新生キットのロット差があるのか、スコアリングに傾向を認めることが困難だった。トリプターゼ添加に関しては、抗体中にアジ化ナトリウムが入っていたため、濃度依存的にスコアリングが下がっている。この結果については現在検討中である。

キマーゼとトリプターゼ添加における血管新生方法 24ウエル上で、ヒト血管内皮細胞と繊維芽細胞を共培養させたもので、管腔形成に関する観察を行った。クラボウより血管新生キット(KZ-1000)を購入し、キット到着日,その3日後、6日後、8日後の計4回の試薬の添加と血管新生キット専用培地の交換を行った。試薬添加後11日目に一次抗体としてMouse anti human CD31抗体で染色し、二次抗体にGoat anti mouse IgG AlkP Conjugateで反応させ、BCIPで発色、視覚化した。1ウエル内を十時にマークして、4ヶ所を顕微鏡10倍で撮影し、NIHimageにより管腔形成量を管腔面責として求め、スコアリングした。スコアリングは4ヶ所の管腔面積を平均したものである。Positive controlとしてVEGF-A、Negative controlとしてsuramin、ControlとしてMediumを用いた。キマーゼ濃度は0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlで、さらに阻害剤10μgを加えたものと比較した。また、トリプターゼ0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml添加したものでも検討を行った。結果 キマーゼ添加に関しては血管新生キットのロット差があるのか、スコアリングに傾向を認めることが困難だった。トリプターゼ添加に関しては、抗体中にアジ化ナトリウムが入っていたため、濃度依存的にスコアリングが下がっている。この結果については現在検討中である。