腎臓における時間空間的に制御可能な臓器細胞特異的遺伝子変異導入システムの開発

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前年度までに、ClC-K2クロライドチャネルの遺伝子プロモーターの下流にレポーター遺伝子としてGFP蛋白を接続し、トランスジェニックマウスを作製、ヘンレの太い上行脚と遠位尿細管に組織細胞特異的なGFPの発現を確認した。また遺伝性の腎性尿崩症において報告されているAQP2水チャネルの遺伝子異常を含む発現ベクターを作製、培養細胞系に遺伝子導入し、実際の細胞内での変異蛋白の発現、挙動、機能を調べたところ、変異タンパクの細胞膜への輸送の異常が確認された。さらにAQP-2プロモーターの下流にこれらの異常を含むAQP2発現ベクターを作製、トランスジェニックマウスを作製したところ、partialな尿崩症を呈していた。本年は、さらにこのアプローチを進め、時間的に制御可能な遺伝子改変システムのマウスへの導入を目指した。(1)遺伝性腎性尿崩症の原因となっている遺伝子異常をAQP2の遺伝子座に相同組み替えを利用してノックインし、より腎性尿崩症の病態を反映したモデルマウスを作製した。現在その形質を検討中である。(2)変異AQP2の発現培養細胞にsiRNAを導入し変異AQP2の発現を抑制することに成功した。現在はこのアプローチをノックアウトマウスに適用し、in vivoでのsiRNAの治療薬として可能性を検討中である。(3)転写因子Kruppel-like factor (KLF)のうちKLF12及びKLF15は出生後約2週の腎臓において発現し始める。腎臓の輸送体の細胞特異的な発現とKLFの関連を探るため、KLF12のコンディショナルノックアウトマウスの作製に着手した。loxP配列を含めてコンディショナルノックアウトベクターを作製し、ES細胞に遺伝子導入,相同組み換えをおこしたESクローンからキメラマウスを得ることに成功した。今後ノックアウトマウスを作製し、形質を検討する。