ヒト由来グルタミルプロリルtRNA合成酵素のX線結晶構造解析

結晶化を行うためのタンパク質およびRNA試料を調製するために、ヒト由来グルタミルプロリルtRNA合成酵素(GluProRS)およびそれと相互作用するtRNA遺伝子のクローニングを行った。はじめに、ヒト肝臓由来cDNAライブラリーに対して、GluProRSの遺伝子の5'末端と3,末端に相補的な配列をもったプライマーを合成してPCRを行い、完全長の構造遺伝子(4,320塩基対)を増幅し、クローニングすることに成功した。大腸菌内で本タンパク質を発現させるために、汎用されているpET系ベクターに遺伝子をサブクローニングし、発現を試みたが、目的タンパク質の発現は認められなかった。GluProRSの大腸菌における細胞毒性の可能性を考慮し、酵母にみられるprotein splicingを応用したIMPACTシステムに遺伝子を組み換えて発現を試みたが、目的タンパク質を効率よく発現させることはできなかった。一方、目的タンパク質と相互作用するtRNAの遺伝子をクローニングし、発現・精製することには成功した。現在は、GluProRSの全長ではなく、機能をもったドメインを発現させて構造解析のターゲットとするための実験を行っている。また、古細菌由来のGluRSは、真核生物由来のGluRSと高い相同性をもっていることが知られているので、試料調製の比較的容易な古細菌由来のGluRSの結晶構造解析をめざした試料調製も開始した。複数の古細菌(Aeropyrum perinix、Sulfolobus tokodaii)から、GluRSおよびtRNAの遺伝子をクローニングし、それぞれの発現系を構築した。GluRSタンパク質およびtRNAを精製し、それらの複合体の結晶化を行っている。

結晶化を行うためのタンパク質およびRNA試料を調製するために、ヒト由来グルタミルプロリルtRNA合成酵素(GluProRS)およびそれと相互作用するtRNA遺伝子のクローニングを行った。はじめに、ヒト肝臓由来cDNAライブラリーに対して、GluProRSの遺伝子の5'末端と3,末端に相補的な配列をもったプライマーを合成してPCRを行い、完全長の構造遺伝子(4,320塩基対)を増幅し、クローニングすることに成功した。大腸菌内で本タンパク質を発現させるために、汎用されているpET系ベクターに遺伝子をサブクローニングし、発現を試みたが、目的タンパク質の発現は認められなかった。GluProRSの大腸菌における細胞毒性の可能性を考慮し、酵母にみられるprotein splicingを応用したIMPACTシステムに遺伝子を組み換えて発現を試みたが、目的タンパク質を効率よく発現させることはできなかった。一方、目的タンパク質と相互作用するtRNAの遺伝子をクローニングし、発現・精製することには成功した。現在は、GluProRSの全長ではなく、機能をもったドメインを発現させて構造解析のターゲットとするための実験を行っている。また、古細菌由来のGluRSは、真核生物由来のGluRSと高い相同性をもっていることが知られているので、試料調製の比較的容易な古細菌由来のGluRSの結晶構造解析をめざした試料調製も開始した。複数の古細菌(Aeropyrum perinix、Sulfolobus tokodaii)から、GluRSおよびtRNAの遺伝子をクローニングし、それぞれの発現系を構築した。GluRSタンパク質およびtRNAを精製し、それらの複合体の結晶化を行っている。