ヒト由来グルタミルプロリルtRNA合成酵素のX線結晶構造解析

人源谷氨酰脯氨酰 tRNA 合成酶的 X 射线晶体结构分析

• 批准号: 14780482
• 负责人: 関根 俊一
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780482/
• 关键词: aminoacylation; aminoacyl-tRNA synthetase; crystallization; tRNA; X-ray crystallography

結晶化を行うためのタンパク質およびRNA試料を調製するために、ヒト由来グルタミルプロリルtRNA合成酵素(GluProRS)およびそれと相互作用するtRNA遺伝子のクローニングを行った。はじめに、ヒト肝臓由来cDNAライブラリーに対して、GluProRSの遺伝子の5'末端と3,末端に相補的な配列をもったプライマーを合成してPCRを行い、完全長の構造遺伝子(4,320塩基対)を増幅し、クローニングすることに成功した。大腸菌内で本タンパク質を発現させるために、汎用されているpET系ベクターに遺伝子をサブクローニングし、発現を試みたが、目的タンパク質の発現は認められなかった。GluProRSの大腸菌における細胞毒性の可能性を考慮し、酵母にみられるprotein splicingを応用したIMPACTシステムに遺伝子を組み換えて発現を試みたが、目的タンパク質を効率よく発現させることはできなかった。一方、目的タンパク質と相互作用するtRNAの遺伝子をクローニングし、発現・精製することには成功した。現在は、GluProRSの全長ではなく、機能をもったドメインを発現させて構造解析のターゲットとするための実験を行っている。また、古細菌由来のGluRSは、真核生物由来のGluRSと高い相同性をもっていることが知られているので、試料調製の比較的容易な古細菌由来のGluRSの結晶構造解析をめざした試料調製も開始した。複数の古細菌(Aeropyrum perinix、Sulfolobus tokodaii)から、GluRSおよびtRNAの遺伝子をクローニングし、それぞれの発現系を構築した。GluRSタンパク質およびtRNAを精製し、それらの複合体の結晶化を行っている。

Line crystallization を う た め の タ ン パ ク qualitative お よ び RNA sample を modulation す る た め に, ヒ ト origin グ ル タ ミ ル プ ロ リ ル tRNA synthetase (GluProRS) お よ び そ れ と interaction す る tRNA heritage 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ を line っ た. は じ め に, ヒ ト routine liver origin cDNA ラ イ ブ ラ リ ー に し seaborne て, GluProRS の posthumous son 伝 の 5 'に と 3 at the end, the end phase of な match column を も っ た プ ラ イ マ ー を synthetic し て PCR line を い, long completely の tectonic heritage 伝 child (4320 salt) seaborne を raised し, ク ロ ー ニ ン グ す る こ と に successful し た. Coliform で within this タ ン パ ク qualitative を 発 now さ せ る た め に, domestic さ れ て い る pET system ベ ク タ ー に posthumous son 伝 を サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し, 発 を now try み た が, purpose タ ン パ ク qualitative の 発 は now recognize め ら れ な か っ た. GluProRS の coliform に お け る cytotoxicity を consider し の possibility, yeast に み ら れ る protein splicing を 応 with し た IMPACT シ ス テ ム に posthumous son 伝 み を group in え て 発 を now try み た が, purpose タ ン パ ク qualitative を sharper rate よ く 発 now さ せ る こ と は で き な か っ た. Party, purpose タ ン パ ク qualitative と interaction す る tRNA の heritage 伝 son を ク ロ ー ニ ン グ し, 発 now refined す る こ と に は successful し た. Now は, GluProRS の span で は な く, function を も っ た ド メ イ ン を 発 now さ せ て structure の タ ー ゲ ッ ト と す る た め の be 験 を line っ て い る. ま た origins, the archaea の GluRS は, eukaryotic origin の GluRS と high い identity を も っ て い る こ と が know ら れ て い る の で, easy modulation の comparison sample な archaea origin の GluRS の crystallization structure を め ざ し た sample modulation も began し た. Plural の archaea (Aeropyrum perinix, Sulfolobus tokodaii) か ら, GluRS お よ び tRNA の posthumous son 伝 を ク ロ ー ニ ン グ し, そ れ ぞ れ の 発 now is を build し た. GluRSタ <s:1> パ パ the homogeneous およびtRNAを is refined, <s:1> and それら the <s:1> complex is crystallized, を rows are って and る る る.