ロドコッカス属細菌によるキラル化合物生産法開発のための基盤的研究

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本年度はRhodococcus erythropolis MAK154株由来のアミノアルコール脱水素酵素(AADH)を用いたdl-1-phenyl-1-keto-2-methylaminopropane (dl-MAK)からd-pseudoephedrineへの変換反応条件の検討と本酵素の機能改変を目的として研究を行った。本酵素は補酵素としてNADPHを要求するため、消費したNADPHを効率的に再利用するための酵素であるグルコース脱水素酵素とAADH遺伝子とをロドコッカス属用発現ベクターであるpREIT19に連結し、R.erythropolis MAK154株を形質転換した。得られた形質転換体を用いて様々な条件を検討した結果、24時間の反応で約190mMの基質より約175mMの生成物が光学純度99% e.e.以上で得ることが可能であった。また、本酵素は生成物の蓄積により反応が阻害されることが明らかとなった。そこで本酵素遺伝子へのerror-prone PCRを用いたランダムな変異の導入により、産物阻害が緩和されるような変異株の取得を試みた結果、2種類の変異酵素が得られた。それぞれの酵素をさらに解析したところ、これら2種類の酵素はいずれも高濃度生成物の存在下でも反応を行うことができたが、生成物阻害が緩和されたのではなく、酵素の活性自体が向上したために生成物阻害が緩和されるように見えるものであった。これら酵素の変異点を解析したところ、一方の変異酵素においては214番目のセリンがアルギニンに置換されたものであった。本酵素と相同性を示す多くの酵素においてはこの部分がアルギニンとして保存されていることから、非常に興味深い結果を得ることができたと考えている。