肝炎ウイルス蛋白と相互作用する宿主内蛋白の同定、および機能解析

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我々は昨年度までにGST-HBx(B型肝炎ウイルスX蛋白)によるPull Downと質量分析を組み合わせた方法を用いてHBxに結合する宿主分子Hsp60を新たに同定し、その機能解析を行った(Tanaka et al., BBRC 2004)。今年度はその手法を改良し、質量分析装置により肝炎ウイルス結合蛋白を探索するための新しい方法論を確立した。まず、MycとFlagの配列の間にTEVプロテアーゼの切断配列をもつdual tag発現プラスミドに肝炎ウイルスの遺伝子産物であるHBxのcDNAをクローニングした。このプラスミドを哺乳類細胞に導入し、Myc・Flagの2つのタグにより肝炎ウイルス蛋白複合体を高純度に精製し、その複合体を形成する蛋白を溶出後、SDS-PAGEにて展開し銀染色を施行。肝炎ウイルスに特異的に結合するバンドをゲルから切り出し、プロテアーゼ消化後MALDI-TOF/MSにより蛋白質の同定を行った。この手法を用いることにより、従来の方法よりもバックグラウンドを低く抑えることが可能となった。予備的な実験でHBxと結合する宿主分子の複合体コンポーネント10分子を同定した。これらの中には、すでにHBxとの結合が報告されているUV-DDB1が含まれていたが、UV-DDB1以外の残りの9つは、従来HBxとの結合が報告されていない分子であった。