肝炎ウイルス蛋白と相互作用する宿主内蛋白の同定、および機能解析

与肝炎病毒蛋白相互作用的宿主蛋白的鉴定和功能分析

• 批准号: 03J61517
• 负责人: 田中 康雄
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J61517/
• 关键词: 肝細胞癌; B型肝炎ウイルス; C型肝炎ウイルス; 質量分析計; プロテオミクス; 肝発癌; affinity purification

我々は昨年度までにGST-HBx(B型肝炎ウイルスX蛋白)によるPull Downと質量分析を組み合わせた方法を用いてHBxに結合する宿主分子Hsp60を新たに同定し、その機能解析を行った(Tanaka et al., BBRC 2004)。今年度はその手法を改良し、質量分析装置により肝炎ウイルス結合蛋白を探索するための新しい方法論を確立した。まず、MycとFlagの配列の間にTEVプロテアーゼの切断配列をもつdual tag発現プラスミドに肝炎ウイルスの遺伝子産物であるHBxのcDNAをクローニングした。このプラスミドを哺乳類細胞に導入し、Myc・Flagの2つのタグにより肝炎ウイルス蛋白複合体を高純度に精製し、その複合体を形成する蛋白を溶出後、SDS-PAGEにて展開し銀染色を施行。肝炎ウイルスに特異的に結合するバンドをゲルから切り出し、プロテアーゼ消化後MALDI-TOF/MSにより蛋白質の同定を行った。この手法を用いることにより、従来の方法よりもバックグラウンドを低く抑えることが可能となった。予備的な実験でHBxと結合する宿主分子の複合体コンポーネント10分子を同定した。これらの中には、すでにHBxとの結合が報告されているUV-DDB1が含まれていたが、UV-DDB1以外の残りの9つは、従来HBxとの結合が報告されていない分子であった。

In the past few years, we have developed a new method for the identification and functional analysis of GST-HBx(hepatitis B virus X protein) by means of a pull-down and mass analysis (Tanaka et al., BBRC 2004)。This year, the new methodology was established for the study of hepatitis B binding protein by improving the method and quality analysis device. In the case of hepatitis B virus, the cDNA of HBx is encoded in the sequence of Myc and Flag. After introduction of the protein into mammalian cells, Myc·Flag 2 was purified to high purity, and the protein complex was formed. SDS-PAGE was performed and silver staining was performed. Hepatitis C virus specific binding protein binding This method is used to reduce the number of possible cases. The prepared HBx binds to the host molecule complex and the host molecule binds to the host molecule. In this case, HBx is reported as a combination of UV-DDB1 and UV-DDB1.

项目成果

Smad4 silencing in pancreatic cancer cell lines using stable RNA interference and gene expression profiles induced by transforming growth factor-beta.

使用稳定的 RNA 干扰和转化生长因子-β 诱导的基因表达谱在胰腺癌细胞系中沉默 Smad4。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Oncogene 24
• 作者: Jazag;A.;Ijichi;H.;Tateishi;K.;Kawakanii;T.;et al.
• 通讯作者: et al.

Proteomic analysis of the TGF-b signaling pathway in pancreatic carcinoma cells using RNA interference to silence Smad4 expression

使用 RNA 干扰沉默 Smad4 表达对胰腺癌细胞中 TGF-b 信号通路进行蛋白质组学分析

• 发表时间: 2004
• 期刊: Biochem.Biophys.Res.Commun. 318
• 作者: Imamura T;Kanai F;Kawakami T et al.
• 通讯作者: Kawakami T et al.

Different effects of point mutations within the B-raf glycine-rich loop in colorectal tumors on MEK/Erk and NF-kB pathway and cellular transformation.

结直肠肿瘤中 B-raf 富含甘氨酸环内的点突变对 MEK/Erk 和 NF-kB 通路和细胞转化的不同影响。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Cancer Res. 64
• 作者: Ikenoue T;Hikiba Y;Kanai F;Aragaki J;Tanaka Y et al.
• 通讯作者: Tanaka Y et al.

Cancer-related Mutations within the Putative Akt Phosphorylation Motif of BRAF do not Enhance its Oncogenic Properties.

BRAF 假定的 Akt 磷酸化基序内的癌症相关突变不会增强其致癌特性。

• 期刊: Molecular Carcinogenesis. (印刷中)
• 作者: Ikenoue T;Kanai F;Hikiba Y;Tanaka Y et al.
• 通讯作者: Tanaka Y et al.

Ikenoue T, Hikiba Y, Kanai F, Tanaka Y, et al.: "Functional Analysis of Mutations within the Kinase Activation Segment of B-Raf in Human Colorectal Tumors."Cancer Research. 63(23). 8132-8137 (2003)

Ikenoue T、Hikiba Y、Kanai F、Tanaka Y 等人：“人类结直肠肿瘤中 B-Raf 激酶激活片段内突变的功能分析”。癌症研究。