B型肝炎ウイルス増殖抑制因子を標的とした新規治療法の開発

B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖は既存の核酸アナログ製剤により抑制することが可能だが、HBVの肝細胞からの完全なる排除はいまだ不可能であり、新規抗ウイルス療法の開発は喫緊の課題である。本研究では、HBxにより分解されるウイルス増殖抑制因子の網羅的同定、またHBxの安定性を規定する宿主因子の網羅的同定を行うことにより、これら新たな分子を標的とした抗ウイルス療法の開発をめざす。本年度は、HBxの安定性を規定する宿主因子の網羅的同定を試みた。２種類のアフィニティータグとTEVプロテアーゼによる切断部位を直列につないだ複合体型タグを組み込んだHBxの発現プラスミドを肝細胞株HepG2に導入し、タグに対する抗体を用いてHBx複合体を2段階精製し、HBx結合蛋白をゲルから切り出し質量分析計にてタンパクを同定した。その中の一つにユビキチンリガーゼCHIP　(Carboxyl-terminus of Hsc70 interacting protein)を認めた。CHIPとHBｘは細胞内で結合し、CHIPを強制発現することによりHBxの発現量は減少した。一方でCHIPのK30A [Heat shock protein 70 (Hsp70)と結合しない変異体]及びH260Q（ユビキチンリガーゼの機能を喪失した変異体）では減少が認められなかった。CHIPをノックアウトした細胞ではHBxの安定性が増し、CHIPの強制発現によりHBxはユビキチン化を受けた。機能的には、HepG2-NTCP細胞でCHIPをノックアウトするとHBV感染時にHBV-RNAやHBVタンパクの産生が増加した。以上よりCHIPはHsp70を介してHBxと結合し、HBｘをユビキチン化している可能性が考えられた。CHIPはHBVの複製に関与している可能性が示唆され、本分子を標的にした抗HBV療法の可能性が示唆された。

B型肝炎ウイルス（HBV）の増殖は既存の核酸アナログ製剤により抑制することが可能だが、HBVの肝細胞からの完全なる排除はいまだ不可能であり、新規抗ウイルス療法の開発は喫緊の課題である。本研究では、HBxにより分解されるウイルス増殖抑制因子の網羅的同定、またHBxの安定性を規定する宿主因子の網羅的同定を行うことにより、これら新たな分子を標的とした抗ウイルス療法の開発をめざす。本年度は、HBxの安定性を規定する宿主因子の網羅的同定を試みた。２種類のアフィニティータグとTEVプロテアーゼによる切断部位を直列につないだ複合体型タグを組み込んだHBxの発現プラスミドを肝細胞株HepG2に導入し、タグに対する抗体を用いてHBx複合体を2段階精製し、HBx結合蛋白をゲルから切り出し質量分析計にてタンパクを同定した。その中の一つにユビキチンリガーゼCHIP　(Carboxyl-terminus of Hsc70 interacting protein)を認めた。CHIPとHBｘは細胞内で結合し、CHIPを強制発現することによりHBxの発現量は減少した。一方でCHIPのK30A [Heat shock protein 70 (Hsp70)と結合しない変異体]及びH260Q（ユビキチンリガーゼの機能を喪失した変異体）では減少が認められなかった。CHIPをノックアウトした細胞ではHBxの安定性が増し、CHIPの強制発現によりHBxはユビキチン化を受けた。機能的には、HepG2-NTCP細胞でCHIPをノックアウトするとHBV感染時にHBV-RNAやHBVタンパクの産生が増加した。以上よりCHIPはHsp70を介してHBxと結合し、HBｘをユビキチン化している可能性が考えられた。CHIPはHBVの複製に関与している可能性が示唆され、本分子を標的にした抗HBV療法の可能性が示唆された。