MCM10蛋白を中心とした真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズム

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DNA複製が開始するには、DNA上の複製開始点として機能する配列に特異的な複製開始因子群が働きかけ、その近傍の二本鎖DNA構造をゆるめる反応を起こすことが必須であると考えられている。大腸菌の複製開始点oriCでは、開始因子であるdnaA蛋白質がdnaA-boxと呼ばれる配列に結合し、これらが集合体となり、まわりにDNAが巻き付いた構造をとる。この複合体形成がきっかけとなり、結合部位に隣接するAT-rich配列が緩み、DNAヘリカーゼが二本鎖DNAの間に入り込むと考えられている。本研究では、はじめにin vitroにおいて非常に効率的なDNA複製系が確立されている大腸菌を用いて、一分子蛍光イメージング技術を用いて複製開始時のDNA構造変化を解析可能な実験系の構築を試みた。まず、Cy3,Cy5それぞれ二種類の蛍光色素をAT-rich領域上の様々な位置に導入した蛍光オリゴDNAを構築し、蛍光イメージアナライザー、及び全反射顕微鏡の下でそれぞれの蛍光強度の変化を解析した。その結果、DNA上の二種類の蛍光色素の距離が変化すると、エネルギー転移効率(FRET効率)が劇的に変化することを見出した。次に、分子クローニングの手法を用いて、AT-rich領域に蛍光色素を導入した蛍光oriCプラスミドを構築し、これを全反射顕微鏡の下での蛍光強度の変化を観察した。その結果、構築した蛍光oriCプラスミド上に導入した蛍光色素間のエネルギー転移反応(FRET)が観察可能であった。本研究では、蛍光oriCプラスミドDNAと複製開姶反応に必要とされるDnaAタンパク質をスライドグラス上で反応さることで、DNAの構造変化に伴ったFRET効率の変化をリアルタイムに検出可能な実験系を構築した。この手法は、真核生物染色体DNA複製初期過程におけるDNA構造変化についても応用可能である