MCM10蛋白を中心とした真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズム

以MCM10蛋白为中心的真核染色体DNA复制叉的分子动力学

• 批准号: 03J83905
• 负责人: 荒木 義雄
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J83905/
• 关键词: 染色体DNA複製; FRET; 一分子解析; DNA複製開始機構; 大腸菌; 出芽酵母; 一分子イメージング; OriC; ARS; 複製フォーク

DNA複製が開始するには、DNA上の複製開始点として機能する配列に特異的な複製開始因子群が働きかけ、その近傍の二本鎖DNA構造をゆるめる反応を起こすことが必須であると考えられている。大腸菌の複製開始点oriCでは、開始因子であるdnaA蛋白質がdnaA-boxと呼ばれる配列に結合し、これらが集合体となり、まわりにDNAが巻き付いた構造をとる。この複合体形成がきっかけとなり、結合部位に隣接するAT-rich配列が緩み、DNAヘリカーゼが二本鎖DNAの間に入り込むと考えられている。本研究では、はじめにin vitroにおいて非常に効率的なDNA複製系が確立されている大腸菌を用いて、一分子蛍光イメージング技術を用いて複製開始時のDNA構造変化を解析可能な実験系の構築を試みた。まず、Cy3,Cy5それぞれ二種類の蛍光色素をAT-rich領域上の様々な位置に導入した蛍光オリゴDNAを構築し、蛍光イメージアナライザー、及び全反射顕微鏡の下でそれぞれの蛍光強度の変化を解析した。その結果、DNA上の二種類の蛍光色素の距離が変化すると、エネルギー転移効率(FRET効率)が劇的に変化することを見出した。次に、分子クローニングの手法を用いて、AT-rich領域に蛍光色素を導入した蛍光oriCプラスミドを構築し、これを全反射顕微鏡の下での蛍光強度の変化を観察した。その結果、構築した蛍光oriCプラスミド上に導入した蛍光色素間のエネルギー転移反応(FRET)が観察可能であった。本研究では、蛍光oriCプラスミドDNAと複製開姶反応に必要とされるDnaAタンパク質をスライドグラス上で反応さることで、DNAの構造変化に伴ったFRET効率の変化をリアルタイムに検出可能な実験系を構築した。この手法は、真核生物染色体DNA複製初期過程におけるDNA構造変化についても応用可能である

DNA replication start point, DNA replication start factor group, DNA start factor group, DNA replication start factor group, DNA replication start factor group, DNA start factor group, DNA replication start factor group, DNA start factor group, DNA replication start factor group, DNA start factor group, DNA replication start factor group E. coli replication start point oriC, start factor dnaA protein dnaA-box, DNA sequence The complex is formed by the AT-rich alignment of adjacent binding sites, DNA fragmentation, and DNA fragmentation. In this study, DNA replication systems with very high efficiency were established in vitro, and DNA structure changes at the start of replication were analyzed and tested in vitro. Cy, Cy3, Cy5 are two types of fluorescent pigments introduced into the AT-rich domain at different locations, including the construction of fluorescent DNA, fluorescent DNA, and the analysis of fluorescent intensity under total reflection micromirrors. As a result, the distance between the two types of fluorescent pigments on DNA has changed, and the FRET efficiency has changed dramatically. In addition, the method of molecular fluorescence detection is used in AT-rich fields, and the fluorescence intensity is observed under total reflection micromirrors. As a result, the construction of the light orients to the introduction of the light pigment space and the generation of the light shift reaction (FRET) can be detected. In this study, the structure of DNA was analyzed and analyzed. The early stages of chromosome DNA replication in eukaryotes

项目成果

Araki Y. et al.: "Budding yeast mcm10/dna43 mutant requires a novel pathway for viability"Genes to Cells. 8(5). 465-480 (2003)

Araki Y.等人：“芽殖酵母mcm10/dna43突变体需要一条新的生存途径”基因到细胞。