生きた細胞内における遺伝子診断を可能にする機能性核酸プローブの設計

设计可实现活细胞基因诊断的功能性核酸探针

• 批准号: 15750141
• 负责人: 山東 信介
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15750141/
• 关键词: ゲノム; DNAzyme; 遺伝子; アロステリック; 診断; FRET; 蛍光; 消光; 遺伝子診断; 細胞; DNA酵素; 細胞内遺伝子診断; 大腸菌; 薬剤; スクリーニング

"細胞膜内における遺伝子検出・診断"を可能にするプローブとして、申請者は標的核酸をアロステリックエフェクターとする自己切断核酸配列(TASC)を提案してきた。まず、コンセプトとの実証に向けて、大腸菌rRNA-12MG1655 strainの16srRNAを標的としたTASCシステムをデザインし、in vitro系における遺伝子検出実験を行った。具体的には、5末端をフルオレセインでラベル化したTASCプローブを設計、合成し、16srRNA存在下における自己切断速度を求めた。その結果、従来のプローブデザインでは、標的非存在下においても、ある程度の自己切断が起こっており、細胞膜内における増幅型遺伝子検出に大きく影響を及ぼすことが予想された。そこで、標的核酸存在下における自己切断速度を軽減するため、TASCシステム中にヘアピンロック構造を形成する核酸配列を導入したLocked TASCプローブを新たにデザインし、この問題を克服した。実際にLocked-TASCシステムを合成し、その活性を測定したところ、およそ、20倍程度のON/OFF効率の上昇が見受けられた。そこで、この改良型TASCプローブに5末端蛍光分子、鎖内消光分子(ダブシル)を導入したFRET型のLocked TASCプローブを設計・合成した。本プローブを用いた細胞外での確認実験のあと、パラホルムアルデヒドで固定化した大腸菌を用いた細胞膜内遺伝子検出実験を行った。その結果、細胞膜内における遺伝子検出、ならびに、細胞膜内におけるシグナルの等温増幅が確認された。

"Within the cell membrane に お け る heritage 伝 検 son out, diagnosis" を may に す る プ ロ ー ブ と し て, applicants は target nucleic acid を ア ロ ス テ リ ッ ク エ フ ェ ク タ ー と す る himself to cut off the nucleic acid with column (TASC) を proposal し て き た. ま ず, コ ン セ プ ト と の card be に to け て, coliform rRNA - 12 mg1655 strain の 16 srrna を mark と し た TASC シ ス テ ム を デ ザ イ ン し, in vitro に お け る heritage 伝 検 out son be 験 を line っ た. Specific に は, 5 end を フ ル オ レ セ イ ン で ラ ベ ル change し た TASC プ ロ ー ブ を し design, synthesis, and the presence of 16 srrna に お け る their cutting speed を め た. そ の results, 従 の プ ロ ー ブ デ ザ イ ン で は, mark the presence of に お い て も, あ る degree の own cut が こ っ て お り, cell membrane に お け る rights type of heritage 伝 son 検 に big き く influence を and ぼ す こ と が to think さ れ た. そ こ で, target nucleic acid in the presence of に お け る their cutting speed を 軽 minus す る た め, TASC シ ス テ ム in に ヘ ア ピ ン ロ ッ を ク structure formation す る nucleic acid with column を import し た Locked TASC プ ロ ー ブ を new た に デ ザ イ ン し, こ の を overcome し た. Be interstate に Locked - TASC シ ス テ ム を synthetic し, そ の determination of active を し た と こ ろ, お よ そ, 20 times の ON/OFF working rate rising の が by け ら れ た. そ こ で, こ の altered TASC プ ロ ー ブ に 5 end 蛍 light, lock the extinction molecules (ダ ブ シ ル) を import し た FRET type の Locked TASC プ ロ ー ブ を design, synthesis し た. This プ ロ ー ブ を with い た extracellular で の confirmation be 験 の あ と, パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド で immobilized し た coliform を with い た membrane heritage 伝 son 検 out be 験 を line っ た. Youdaoplaceholder0 <s:1> results, における residues of 伝 in the cell membrane 検, ならびに, isothermal increase of におけるシグナ in the cell membrane が confirmation された.

项目成果

Locked TASC Probe for Homogeneous Sensing of Nucleic Acids and Imaging of Fixed E.coli Cells

用于核酸均匀传感和固定大肠杆菌细胞成像的锁定 TASC 探针

• 期刊: Organic & Biomolecular Chemistry (in press)
• 作者: Shinsuke Sando;Atsushi Narita;Toshinori Sasaki;Yasuhiro Aoyama
• 通讯作者: Yasuhiro Aoyama