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ラディキシンFERMドメインと三量体Gタンパク質αサブユニットの複合体結晶解析

radixin FERM 结构域和三聚体 G 蛋白 α 亚基的复合晶体分析

基本信息

批准号：
15770068
负责人：
北野健
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Nara Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では,ERM (ezrin/radixin/moesin)タンパク質のひとつであるラディキシンのFERMドメインと,三量体Gタンパク質αサブユニットの複合体を調製・共結晶化し,その複合体構造を決定することを目的とした研究をおこなった。前年度に,GαとFERMドメインを複合体形成させた状態で精製することを試みたが,Gαが不溶化してしまう問題を解決することができなかった。そこで,Gαを全長ではなく,FERMドメインと相互作用する部位のみを切り出して発現させることを試みた。特定の二次構造を形成しておらず,フレキシブルと考えられる部位については,ペプチド合成による試料調製をおこなった。これらのGαドメインおよびペプチドと,前年度に精製したFERMドメインを用いて,プルダウンおよび表面プラズモン共鳴センサーによる分子間結合実験をおこなった。その結果,細胞内シグナル伝達における結合能として妥当と考えられる結合を観測することができた。ふたつのタンパク質を用いた共結晶化実験を行ったところ,複合体の結晶はまだ得られていないが,FERMドメインの単体が2量体形成した新しい結晶系の結晶を得ることができた。SPring-8でX線回折実験をおこない,分解能2.9Åのフルデータを収集した。分子置換法による位相決定をおこない,構造の精密化をおこなった結果,信頼度因子R/R_<free>=25/28%の立体構造を決定することができた。現在,論文を投稿準備中である。また,ゲノムの安定性を維持するのに重要なヒト由来のタンパク質複合体であるFEN1-PCNAと,細菌A.xylanus由来の過酸化物分解酵素ペルオキシレドキシンン(AhpC)の結晶構造解析に成功し,それぞれを国際科学雑誌にて発表した。

In this study,ERM (ezrin/radixin/moesin) complexes were modulated and co-crystallized to determine the structure of FERM complexes. In the previous year, we tried to refine the Gα and FERM Del Meinin complex into a state where it was formed, and solved the problem of Gα insolubilization. The total length of Gα is 0, 0 Specific secondary structures are formed, and the sample is modulated. In the past year, FERM has been refined and used in the field of molecular binding. As a result, intracellular binding energy is properly measured. For example, if a compound is formed by co-crystallization, the compound is crystallized. SPring-8 X-ray retroflexion, resolution energy 2.9 ° C The molecular substitution method determines the phase, the precision of the structure, and the reliability factor R/R_<free>=25/28%. Now, the paper is ready for submission. In addition, the crystal structure analysis of the peracid-decomposing enzyme AhpC derived from bacteria A.xylanus, which is important for maintaining the stability of the protein, has been successfully reported in international scientific journals.