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異性化タンパク質修復の分子機構の解明

阐明异构化蛋白质修复的分子机制

基本信息

批准号：
15790024
负责人：
野口修治
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト由来イソアスパラギン酸メチル基転移酵素(hPIMT)の分子表面に存在して容易に酸化されてタンパク質の変性を促進させると考えられたシステイン残基をセリンに置換した変異体タンパク質の発現系を構築し、精製方法を検討した。硫安沈殿では、目的タンパク質は硫安1.5Mから2.0Mの範囲で沈殿することがわかった。また、目的タンパク質はpH7.5で陰イオン交換クロマトカラムに吸着し、NaCl濃度が0.15Mから0.20Mで溶出されることがわかった。硫安分画と陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた精製法により培養液1リットルあたり約10mgの精製タンパク質試料が得られた。hPIMTのN末端及びC末端の数アミノ酸残基は定まったコンフォメーションを形成せず、立体構造保持にも酵素活性にも関わらないと考えられるが、それらのアミノ酸残基を取り除いた変異体タンパク質の発現系も構築した。精製条件を検討したところ、ほぼ同様の手順で精製タンパク質試料を得ることができ、その収量は培養液1リットルあたり約12mgであった。メチル基転移反応の結果生じるS-アデノシルホモシステイン存在下、及びS-アデノシルホモシステインとイソアスパラギン酸を含む基質ペプチドの共存下で結晶化を試みたが、アモルファス状の沈殿のみが得られた。本研究で確立したhPIMTの発現系と精製方法を応用すれば、結晶化を阻害すると考えられる分子表面のアミノ酸残基を種々に置換した変異体タンパク質を容易かつ大量に精製することができ、hPIMT変異体と基質ペプチドとの複合体の結晶化を行う際にタンパク質結晶工学的手法を適用することが可能になった。

The molecular surface of hPIMT is easy to acidify, and the quality of hPIMT is easy to promote. The method of constructing and purifying hPIMT is discussed. 1.5M The target substance is pH 7.5, the anion exchange substance is adsorbed, the NaCl concentration is 0.15M, the dissolution is 0.20M. The culture medium was prepared by the purification method, and about 10mg of the purified sample was obtained. The N-terminal and C-terminal amino acid residues of hPIMT were determined to form the protein, and the stereostructure was maintained to form the enzyme activity. The purification conditions are as follows: 1. The amount of culture medium is about 12mg. In the presence of a matrix, a matrix, a crystal, a crystal, and a crystal in the presence of a matrix, a crystal in the presence of a matrix, and a crystal in the presence of a matrix, the crystal is crystallized. This study established that hPIMT production system and purification method can be applied to the crystallization process of hPIMT heterogeneous matrix complex.