コンホメーショナルディジーズの解明を目指してのNMRを用いた蛋白質の変性構造解析

使用 NMR 分析蛋白质的变性结构，旨在阐明构象疾病

基本信息

批准号：
15790028
负责人：
大栗誉敏
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、リゾチームをモデルに、アミノ酸変異による変性構造変化がどのように凝集反応と結びつくかを調べることである。還元リゾチームは強い変性条件下でさえも疎水クラスター(A9,W28,W62,W108,W111,W123からなる)を形成する事が報告されているが、我々のグループはTrp62Gly変異体ではその疎水クラスターがすべて崩壊することをNMRの緩和解析により明らかにした。15年度ではリゾチームの4つのSS結合を1つだけ保持するような種々の変異体とこれらにW62G変異を加えた変異体の計16種を作製し、還元変性状態に近いモデルを構築した。結果として変性構造がSSの優位な形成に寄与し、変性構造が崩壊するとSS結合形成がランダムに起こることが示唆された。16年度において、野生型及びW62G変異体についてSS結合を化学修飾で還元状態にしたリゾチームを作製し、フォールディング条件下におけるアグリゲーション反応の比較を行った。その結果、変性構造が崩壊するW62G変異体は野生型に比べアグリゲーション反応へ導かれる事が示唆された。一方で2004年に酸性条件下で還元状態のリゾチームがアミロイド形成を起こすという論文が報告された。そこで野生型及びW62G変異体の還元修飾体を用いてその酸性条件下でアミロイド形成実験を行った。CD測定とチオフラビンT存在下での蛍光測定より、変性構造をもたないW62G変異体の方はアミロイド形成を起こしにくい事が分かった。以上の結果から変性構造はアグリゲーション反応を抑制し効率的なフォールディング過程を導く反面、条件の変化でアミロイド形成が起こりやすくなることが示唆された。即ち、変性構造がアミロイド形成に関与する事を初めて証明することに成功した。本成果はJ.Mol.Biol(2005)347,159-168に掲載された。また疎水コアの各アミノ酸残基のGly変異体を調製しNMR緩和解析を行った。その結果、W62Gのように疎水コアが全て崩壊するのではなく、変異によって部分的な変性構造を形成する事が分かった。即ち、変性構造のバリエーションを得ることに成功した。この変異体を用いる事でさらに変性構造とアミロイド形成の関与を追求する事が可能であろう。

这项研究的目的是研究氨基酸突变引起的结构变化如何与使用溶菌酶作为模型的凝集反应有关。据报道，还原性溶菌酶也形成疏水簇（由A9，W28，W62，W108，W111和W123组成），即使在强烈的变性条件下，NMR松弛分析揭示了所有疏水簇在TRP622GLENT中分解。在2015财年中，总共有16种变体，其中包括仅保留一种溶菌酶结合的各种突变体，并创建了添加了W62G突变的突变体，并创建了一个接近变性状态的模型。结果，修饰的结构有助于SS的主要形成，这表明当修饰的结构倒塌时，SS键形成随机发生。 2014年，产生了溶菌酶，其中将SS结合放入降低的状态，并为野生型和W62G突变体进行化学修饰，并比较折叠条件下的聚集反应。结果表明，与野生型相比，具有变性结构的W62G突变体导致聚集反应。同时，在2004年，据报道，在酸性条件下降低的状态下的溶菌酶会导致淀粉样蛋白形成。因此，淀粉样蛋白形成实验是在酸性条件下使用野生型和W62G突变体的修饰进行的。在存在硫非类黄酮T的情况下，CD的测量和荧光测量表明，没有贬低结构的W62G突变体不太可能引起淀粉样蛋白形成。以上结果表明，虽然修饰的结构抑制了聚集反应并导致有效的折叠过程，但由于条件的变化，淀粉样蛋白形成更可能发生。也就是说，它已经成功地证明了修改的结构参与淀粉样蛋白形成。这一发现发表在J.Mol。 Biol（2005）347，159-168。另外，制备了疏水核中每个氨基酸残基的Gly突变体，并进行了NMR弛豫分析。结果，发现不是像W62G这样的疏水核心完全分解，而是发现突变构成部分变性的结构。也就是说，我们成功地获得了修改结构的变化。使用这种突变体将进一步帮助追求变性结构和淀粉样蛋白形成。