タンパク質リン酸化酵素Aktの基質分子の網羅的同定と機能解析

Aktは、細胞生存維持や糖代謝などの細胞機能において非常に重要な役割を担うタンパク質リン酸化酵素である。本研究は、Aktの基質の網羅的同定をプロテオミクス技術を応用して行い、Aktの細胞内機能の詳細を明らかにする事を目的とするものである。基質の同定は、金属キレート親和性カラムによるリン酸化タンパク質の濃縮法と2次元電気泳動を組み合わせた手法により行う。前年度までの研究結果に基づき、今年度は金属固定化アフィニティーカラムによるリン酸化タンパク質の精製法の評価を行った。複数個のリン酸化を受けるalpha-casein、beta-caseinおよび全くリン酸化を受けないBSA、リゾチームを用いて精製の特異性の検討を行った。その結果、非リン酸化タンパク質であるBSA、リゾチームはカラムへほとんど結合しなかったのに対して、リン酸化タンパク質であるalpha-、beta-caseinは、80%以上がカラムに結合することが分かった。さらに、リン酸化タンパク質を含む細胞抽出液および脱リン酸化酵素処理によりタンパク質からリン酸基を除いた細胞抽出液を用いてカラムの結合特異性の詳細な検討を行った。その結果、脱リン酸化の処理により、タンパク質のカラムへの吸着は顕著に減少する事が分かった。以上の研究結果により、金属キレート親和性カラムは非常に特異的にリン酸化タンパク質を吸着すること、また本精製法によりリン酸化タンパク質を約10倍に濃縮出来る事を示した。本研究結果により金属固定化アフイニティーカラムがリン酸化タンパク質の精製に非常に有効である事を示した。

Aktは、細胞生存維持や糖代謝などの細胞機能において非常に重要な役割を担うタンパク質リン酸化酵素である。本研究は、Aktの基質の網羅的同定をプロテオミクス技術を応用して行い、Aktの細胞内機能の詳細を明らかにする事を目的とするものである。基質の同定は、金属キレート親和性カラムによるリン酸化タンパク質の濃縮法と2次元電気泳動を組み合わせた手法により行う。前年度までの研究結果に基づき、今年度は金属固定化アフィニティーカラムによるリン酸化タンパク質の精製法の評価を行った。複数個のリン酸化を受けるalpha-casein、beta-caseinおよび全くリン酸化を受けないBSA、リゾチームを用いて精製の特異性の検討を行った。その結果、非リン酸化タンパク質であるBSA、リゾチームはカラムへほとんど結合しなかったのに対して、リン酸化タンパク質であるalpha-、beta-caseinは、80%以上がカラムに結合することが分かった。さらに、リン酸化タンパク質を含む細胞抽出液および脱リン酸化酵素処理によりタンパク質からリン酸基を除いた細胞抽出液を用いてカラムの結合特異性の詳細な検討を行った。その結果、脱リン酸化の処理により、タンパク質のカラムへの吸着は顕著に減少する事が分かった。以上の研究結果により、金属キレート親和性カラムは非常に特異的にリン酸化タンパク質を吸着すること、また本精製法によりリン酸化タンパク質を約10倍に濃縮出来る事を示した。本研究結果により金属固定化アフイニティーカラムがリン酸化タンパク質の精製に非常に有効である事を示した。