Pasteurella multocida毒素の細胞内標的分子の検索

寻找多杀性巴氏杆菌毒素胞内靶分子

• 批准号: 15790221
• 负责人: 岡 清正
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790221/
• 关键词: Pasteurella multocida毒素; 細胞内標的分子; 細胞増殖; 発現クローニング; DNA合成; サイクリンA

Pasteurella multocida毒素(PMT)は培養細胞に対して強い増殖促進因子として働き、細胞周期が静止期にある細胞のDNA合成を誘導する。現在まで、PMTの作用機構に関してはほとんど分かっでいない。本研究ではPMTの細胞内標的分子を明らかにするため、PMTによる細胞DNAの合成誘導を指標にした発現クローニングを試みた。細胞周期がDNA合成期(S期)に移行するためにはサイクリンAの発現が必須である。そこで、サイクリンAプロモーターの下流にEGFPを結合させたプラスミド(pCyc.A-d2EGFP)をレポーター遺伝子として用いた。またEGFPの半減期は24時間以上で、このままではEGFP陽性細胞を分別する事が出来ないため、半減期が2時間となるように分解シグナルを付加したd2EGFPを用いている。レポーター遺伝子を導入するPMT非感受性細胞として、ヒト初代培養細胞をSV40で不死化させたHFI細胞を用いた。この細胞にpCyc.A-d2EGFPからSVoriを除いたものを導入し、安定発現株をFACSにより回収した。スクリーニングのためのcDNAライブラリーは、PMT高感受性細胞であるSwiss3T3細胞からmRNAを調製し、リンカープライマー法により作製した。このSwiss3T3cDNAライブラリーを先程のHFI細胞に導入後PMTを作用させ、EGFP陽性となった細胞をFACSで回収した。得られた細胞群からハート法によりプラスミドを回収した。このスクリーニングを合計3回行い、最終的に得られたクローンについて解析中である.また、PMTは三量体GTP結合タンパク質Gqを介してホスフォリパーゼCを活性化すると考えられている。このシグナル伝達経路はGqと共役する膜受容体(GPCR)の活性化から始まるので、PMTの作用点も細胞膜にあると推測される。そこで、培養細胞、GPCRが多く存在する脳、PMTの作用が観察されたとの報告がある肝臓から膜画分を回収し、PMTを作用させてから2次元電気泳動を行った。様々な条件下で2次元電気泳動を行ったが、コントロールと差異のあるスポットは検出されていない

Pasteurella multocida toxin (PMT) induces DNA synthesis in cultured cells by enhancing proliferation promoting factors and cell cycle quiescence. Now, PMT's function mechanism is related to the function of PMT. In this study, the molecular markers of PMT intracellular target were identified and the markers of PMT cellular DNA synthesis were identified. Cell cycle DNA synthesis phase (S phase) transition is necessary for the development of cell cycle A. The downstream EGFP is combined with the downstream EGFP (pCyc.A-d2EGFP). EGFP positive cells were separated from EGFP positive cells by 24 hours or more. EGFP positive cells were separated from EGFP positive cells by 2 hours or more. PMT non-susceptible cells introduced into the cell culture medium were used in SV40 and HFI cells. The pCyc.A-d2EGFP was introduced into the cells and the stable cells were recovered. Swiss 3T3 cells are highly sensitive to PMT, and their mRNA levels are modulated and regulated by cDNA. The Swiss 3T3 cDNA was introduced into the HFI cells and the EGFP positive cells were recovered by FACS. The cell population was divided into two groups: Total 3 loops, final analysis. PMT is a three-dimensional GTP binding agent. The activation of GPCR and the site of action of PMT in the cell membrane are speculated. The results showed that there was no significant difference between the two groups, especially in the presence of GPCR and PMT. Under the same conditions, the two-dimensional electrokinetic behavior is different.

项目成果

Takeshi Matsuzawa, et al.: "Boldetella dermonecrotic toxin undergoes proteolytic processing to be translocated form a dynamin-related endosome into the cytoplasm in an acidification-independent manner."J.Biol.Chem.. 279. 2866-2872 (2004)

Takeshi Matsuzawa 等人：“博德氏菌皮肤坏死毒素经历蛋白水解加工，以不依赖酸化的方式从动力相关内体转移到细胞质中。”J.Biol.Chem.. 279. 2866-2872 (2004)