変異型サイトケラチン遺伝子導入による中間径フィラメントと細胞質内凝集体の機能解析

通过引入突变细胞角蛋白基因对中间丝和细胞质聚集体进行功能分析

• 批准号: 15790371
• 负责人: 花田 慎一郎
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790371/
• 关键词: アグリソーム; サイトケラチン; マロリー体; 国際情報交換; 中間径フィラメント; 凝集体; タイト結合; 接着結合; 遺伝子導入; GFP; ゴルジ装置

【目的】中間径フィラメント(IF)を含む細胞骨格はjunctional complexと密接な関係を持つが、タイト結合(TJ)、接着結合(AJ)とIFとの関連は不明である。一方、各種肝疾患ではIFの網目構造消失と凝集体形成がみられ、この形態学的特徴はマロリー体として知られているが、その細胞生物学的意義は不明である。今回我々は培養細胞を用い、変異型サイトケラチン(CK)遺伝子導入による凝集体形成時のTJ、AJ関連蛋白を含む細胞内蛋白の局在、細胞形態について検討した。【方法】Green fluorescent proteinで標識した野生型、変異型CK18遺伝子(arg89cys ; CK18 R89C)を作製し、培養ヒト肝癌由来細胞(Huh7)、ヒト不死化肝細胞(OUMS-29)、MDCK細胞、HEK293細胞に遺伝子導入を行った。48時間後、「間接蛍光抗体法にて各種蛋白を染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。また、変異型CK18遺伝子導入細胞を電子顕微鏡にて観察した。【成績】変異型CK18遺伝子導入によりIFの網目構造が消失し、凝集体が形成された。これらの細胞では細胞面積の増加と形態変化がみられた。電子顕微鏡による観察では、凝集体は形質膜を持たず、細胞内小器官を含有し、周囲には線維性構造物がみられた。免疫染色では、膜裏打ち蛋白(ZO-1、β-catenin、desmoplakin)、glucose-6-phosphate dehydrogenase、14-3-3ζ蛋白は凝集体と共在していた。この局在変化は膜蛋白(occludin、 E-cadherin)ではみられなかった。【結論】IFの関与する凝集体形成は細胞内蛋白の局在に影響を与え、その結果細胞の機能に影響を与えることが推測される。またIFが細胞の形態維持に重要であると考えられた。

[Objective] Intermediate diameter (IF) includes cellular skeleton, junctional complex and close contact relationship. The relationship between intermediate diameter (IF), junctional complex and close contact relationship between intermediate diameter (IF) and cell skeleton is unknown. In one case, various liver diseases, IF the mesh structure disappears, the aggregation is formed, the morphological characteristics of the aggregation are known, and the cellular biological significance of the aggregation is unknown. In this paper, we have studied the application of different types of protein in cultured cells, the introduction of TJ and AJ-related proteins, the presence of intracellular proteins and the morphology of cells. [Methods] Green fluorescent protein was identified by wild-type and variant CK18 gene (arg89cys ; CK18 R89C) and introduced into cultured hepatoma-derived cells (Huh7), non-dead hepatocytes (OUMS-29), MDCK cells and HEK293 cells. 48 hours later, indirect fluorescent antibody staining of various proteins, confocal microscopy The introduction of heteromorphic CK18 genes into cells was observed by electron microscopy. [Results] Different CK18 gene introduced, IF mesh structure disappeared, aggregate formed. The size of the cells increased and the morphology changed. Microscopic examination of the plasma membrane of the condensate, the small organs of the cell, and the linear structure of the cell Immunostaining for ZO-1, β-catenin, desmoplakin, glucose-6-phosphate dehydrogenase, 14-3-3 zeta protein aggregates. In this case, occludin, E-cadherin, etc. [Conclusion] IF is related to the formation of aggregates, which may affect the function of intracellular proteins. If the cell is maintained,