第二高調波発生による生体組織内部の細胞膜電位計測

通过二次谐波产生测量生物组织内的细胞膜电位

• 批准号: 04J08038
• 负责人: 小林 実
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J08038/
• 关键词: 第二高調波発生; レーザー走査顕微鏡; フェムト秒レーザー; マイクロレンズアレイ; 膜電位; パッチクランプ

本研究の目的は、生体組織内部での細胞膜電位の時間的・空間的な変化を1ミリ秒の時間分解能で可視化する技術の開発である。この技術においては非線形感受率が膜電位に依存するプローブ分子によって脳組織の細胞膜を標識し、この分子からの第二高調波発生(SHG)を検出することにより細胞膜電位の空間的分布を計測する。生体透過率が高い近赤外域において発振するモード同期チタンサファイアレーザを光源に用い、組織内部での第二高調波発生を測定可能な装置を試作した。マイクロレンズアレイによる多焦点同時走査によって、細胞膜電位の計測に必要な1msの時間分解能を達成した。SHGを検出する際に、背景光となる蛍光による影響を除去するために、信号光を時間分割して検出する方法についてReview of Scientific Instruments誌にて発表した。本手法においては、ゲート付きイメージインテンシファイアを用いることにより、マイクロレンズアレイによって形成された複数の焦点からの光を同時に時間分割検出した。その結果、SHGと背景光となる蛍光の検出比を10^3以上にできること、また、検出器の暗電流を99.4%減少させることができることを確認した。入射光の偏光に対する第二高調波発生の強度、偏光、放射パターンを解析し、より効率よく第二高調波を検出する方法を検討した。光軸に垂直な細胞膜からのSHGを効率よく検出するために必要な、入射光の焦点において光軸に平行な電場成分が、対物レンズの瞳面に、分割波長板を設置することで増強できることを数値計算によって確認した。実際に、対物レンズの瞳面に8分割の位相板を挿入することで光軸に平行な電場成分が増強されることを確認し、細胞膜の第二高調波像を取得した。

The purpose of this study is to develop a technique for visualizing temporal and spatial changes in cell membrane potentials in living tissues. This technique is used to measure the spatial distribution of cell membrane potential, which depends on the non-linear sensitivity of the molecule, the identification of the cell membrane of the tissue, and the detection of the second high-profile emission (SHG) of the molecule. A device for measuring the transmission of light from a source of light and the transmission of light from a second source of light in a tissue is being tested. Multi-focus simultaneous detection and measurement of cell membrane potential can be achieved within 1ms SHG detection time, background light, background light This method is to divide the light into two parts: one part is to divide the light into two parts; the other part is to divide the light into two parts. As a result, SHG and background light have a detection ratio of more than 10^3, and the dark current of the detector has been reduced by 99.4%. The intensity, polarization and emission of the second high-profile wave of incident light are discussed. Optical axis perpendicular to the cell membrane, SHG efficiency, necessary, incident light focus, parallel to the optical axis, pupil plane, split wavelength plate, setting, intensity, numerical calculation, confirmation In the meantime, the phase plate of the pupil plane of the object is divided into 8 parts, and the electric field component parallel to the optical axis is increased. The second high-pitched wave image of the cell membrane is obtained.