試験管内翻訳系を用いたシスタチオニンγ・シンターゼのmRNA安定性制御機構の研究

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シロイヌナズナのシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)は高等植物におけるメチオニン生合成の鍵段階を触媒する.CGSの発現はメチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン(SAM)に応答して負のフィードバック制御を受け,この制御はmRNAの安定性の制御によって行われる.この制御にはMTO1領域と名付けた,CGSの第1エキソンにコードされる十数アミノ酸の配列がシス配列として必要であり,フィードバック非感受性となったシロイヌナズナmto1変異株では,このシス配列内にアミノ酸変異を持つ.SAMの作用機構を調べるため,CGS第1エキソンのコード領域を持つmRNAを試験管内で転写させ,コムギ胚芽抽出液の試験管内翻訳反応での解析を行った.MTO1領域がSAMとの相互作用に関わっているとの作業仮説を立て,放射能標識されたSAM存在下で試験管内翻訳を行うことにより,SAMが翻訳中のリボソームと結合している可能性を検討した.試験管内翻訳反応液中に存在すると考えられるリボソーム分子に対して,制御に効果を示すのに必要なSAMの濃度が数桁高いため,極めてバックグラウンドの高い実験である.遊離のSAMを除去するために,限外ろ過,超遠心等の操作を行った後にフィルターバインディング実験を行った.野生型のmRNA配列を翻訳させた場合の方が,mto1変異を持つmRNAを翻訳させた場合より放射活性が高い傾向が見られたが,有意差を示すには至っていない.遊離SAMの除去方法を検討すると共に,クロスリンクの条件検討を行っている.