tRNA切断酵素を用いた動物細胞tRNAのノックダウンに対する細胞応答の解析

コリシンE5,Dによる細胞質tRNAノックダウンに対する細胞応答の解析これまで、細胞内で発現させるコンストラクトとして、コリシンE5,DのC末端活性ドメイン(E5-CRD, D-CRD)を用いていたが、様々な実験結果から、これらが細胞内で安定的に存在できないことが考えられた。一方、別の実験結果から、E5-CRD, D-CRDのN末端にGFPを融合させたコンストラクト(GFP-E5,GFP-D)は、細胞内で安定化する可能性があることを偶然見いだした。そこで、このGFP-E5,GFP-Dを細胞内で発現させウエスタンブロットを行った結果、予想される分子量の位置にGFP-E5のバンドが検出された。一方、GFP-Dは、GFPに由来すると思われるバンドのみが検出され、C末端のD-CRD領域が分解されていることが分かった。D-CRDのN末端に細胞内で不安定化する領域があると考え、N末を削ったD-CRDをGFPと融合させた結果、細胞内で安定的に発現するようになった。そこで、筑波大学三輪博士の作製されたEpstein-Barr virus由来のエピゾーマルベクターを用い、これらをTet-Onにより発現制御出来る安定株をHeLa細胞を元に作製し、細胞内で発現させたところ、細胞周期のいずれかの位置で増殖が停止していることを示唆する結果が得られた。出芽酵母を用いて同様の実験を行ったところ、やはり同様の結果が得られた。また、この際の遺伝子発現変動の様子を、出芽酵母をベースにDNAマイクロアレイにより解析した。その結果、tRNA, rRNAの合成に関与する遺伝子の発現が上昇し、逆にアミノ酸生合成に関与する遺伝子発現が低下していることが分かった。

コリシンE5,Dによる細胞質tRNAノックダウンに対する細胞応答の解析これまで、細胞内で発現させるコンストラクトとして、コリシンE5,DのC末端活性ドメイン(E5-CRD, D-CRD)を用いていたが、様々な実験結果から、これらが細胞内で安定的に存在できないことが考えられた。一方、別の実験結果から、E5-CRD, D-CRDのN末端にGFPを融合させたコンストラクト(GFP-E5,GFP-D)は、細胞内で安定化する可能性があることを偶然見いだした。そこで、このGFP-E5,GFP-Dを細胞内で発現させウエスタンブロットを行った結果、予想される分子量の位置にGFP-E5のバンドが検出された。一方、GFP-Dは、GFPに由来すると思われるバンドのみが検出され、C末端のD-CRD領域が分解されていることが分かった。D-CRDのN末端に細胞内で不安定化する領域があると考え、N末を削ったD-CRDをGFPと融合させた結果、細胞内で安定的に発現するようになった。そこで、筑波大学三輪博士の作製されたEpstein-Barr virus由来のエピゾーマルベクターを用い、これらをTet-Onにより発現制御出来る安定株をHeLa細胞を元に作製し、細胞内で発現させたところ、細胞周期のいずれかの位置で増殖が停止していることを示唆する結果が得られた。出芽酵母を用いて同様の実験を行ったところ、やはり同様の結果が得られた。また、この際の遺伝子発現変動の様子を、出芽酵母をベースにDNAマイクロアレイにより解析した。その結果、tRNA, rRNAの合成に関与する遺伝子の発現が上昇し、逆にアミノ酸生合成に関与する遺伝子発現が低下していることが分かった。