普遍的リボヌクレアーゼを介した新規バイオフィルム形成制御機構の解明

これまでの成果から、不活性型リボソーム（100Sリボソーム）がRNase Iと直接相互作用し、活性を阻害するという、本研究における仮説の妥当性が示されてきた。そこで、これらをより詳細に解析するために、以下の実験を行った。活性型リボソーム（70Sリボソーム）に対し、休眠因子を作用させることで、試験管内で不活性型リボソームを調製した。そして、調製した不活性型リボソームによるRNase Iの活性阻害の程度を評価した。その結果、活性型リボソームと比較して、不活性型リボソームはRNase Iの活性をより強く阻害することが分かった。また、活性型および不活性型リボソームを試験管内翻訳系に添加し、翻訳反応を開始させた。その後、RNase Iを加えることで、両リボソームとRNase Iとの結合能を比較した。その結果、RNase Iが、翻訳伸長を行っているリボソームに対して結合しづらいことを明らかにした。また、mRNA無添加の試験管内翻訳系、すなわちペプチド伸長が起こらない系に対して活性型リボソーム、およびRNase Iを添加すると、両者は良く結合した。以上のことから、RNase Iは、ペプチド伸長を停止させているリボソームに対して高い結合能を持つことがわかった。現在、この結果を補強するために、一分子イメージングによる解析に取り組んでいる。また、RNase Iがリボソームのいずれの部位と結合するかを明らかにするために、クライオ電子顕微鏡観察により、RNase Iとリボソームとの複合体構造を決定した（大阪大学との共同研究）。その結果、RNase Iは30Sリボソームサブユニットの特異的部位に結合することが示され、また、そのユニークな結合様式を明らかにすることが出来た。

これまでの成果から、不活性型リボソーム（100Sリボソーム）がRNase Iと直接相互作用し、活性を阻害するという、本研究における仮説の妥当性が示されてきた。そこで、これらをより詳細に解析するために、以下の実験を行った。活性型リボソーム（70Sリボソーム）に対し、休眠因子を作用させることで、試験管内で不活性型リボソームを調製した。そして、調製した不活性型リボソームによるRNase Iの活性阻害の程度を評価した。その結果、活性型リボソームと比較して、不活性型リボソームはRNase Iの活性をより強く阻害することが分かった。また、活性型および不活性型リボソームを試験管内翻訳系に添加し、翻訳反応を開始させた。その後、RNase Iを加えることで、両リボソームとRNase Iとの結合能を比較した。その結果、RNase Iが、翻訳伸長を行っているリボソームに対して結合しづらいことを明らかにした。また、mRNA無添加の試験管内翻訳系、すなわちペプチド伸長が起こらない系に対して活性型リボソーム、およびRNase Iを添加すると、両者は良く結合した。以上のことから、RNase Iは、ペプチド伸長を停止させているリボソームに対して高い結合能を持つことがわかった。現在、この結果を補強するために、一分子イメージングによる解析に取り組んでいる。また、RNase Iがリボソームのいずれの部位と結合するかを明らかにするために、クライオ電子顕微鏡観察により、RNase Iとリボソームとの複合体構造を決定した（大阪大学との共同研究）。その結果、RNase Iは30Sリボソームサブユニットの特異的部位に結合することが示され、また、そのユニークな結合様式を明らかにすることが出来た。