tRNAを標的とするコリシンE5の特性を活かした応用的利用法の確立

建立利用大肠菌素 E5 靶向 tRNA 特性的应用方法

• 批准号: 14760042
• 负责人: 小川 哲弘
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760042/
• 关键词: tRNA; リボヌクレアーゼ; 細胞致死; ミトコンドリア; 基質認識

(1)コリシンDの基質認識メカニズムの解明コリシンDの活性ドメインおよびインヒビターとの共結晶構造を決定した。以前の研究成果より、コリシンDの活性中心残基をひとつ同定しており(His611)、これを元に残りの残基を構造データに基づき予測した。予測されたアミノ酸を置換した変異体コリシンDを発現、精製し、in vitroでの活性を調べた結果、Lys608を変異させた変異体コリシンDが著しい活性の低下を示した。このことから、Lys608が残りの活性中心残基であると考えられる。(2)コリシンE5やDの応用的利用法の確立コリシンおよびインヒビターを個々に発現するプラスミドをそれぞれ作製し、HeLa細胞に導入した。この細胞のタンパク合成活性を、同時に導入したプラスミドより発現するルシフェラーゼの合成量により評価した。その結果、野生型コリシンE5, Dを発現する細胞では、著しいタンパク合成低下が見られ、この活性はインヒビターを共発現させることにより阻害された。このことから、動物細胞内でも、コリシンE5, Dが活性を示し、また、インヒビターにより活性のオン・オフが可能であることが分かった。現在、コリシンE5,DをTet系により誘導発現出来るトランスジェニックマウスを作製中である。このマウスを解析することにより、tRNAの障害に対して個体レベルでどのような疾患が生じるか調べることが可能である。また、同時にコリシンをミトコンドリアに局在化させることにより、ミトコンドリアをノックダウンさせる系を、細胞レベルで構築中である。

の substrate (1) コ リ シ ン D know メ カ ニ ズ ム の interpret コ リ シ ン D の active ド メ イ ン お よ び イ ン ヒ ビ タ ー と の cocrystallization tectonic を decided し た. Research achievements before の よ り, コ リ シ ン D の active center residues を ひ と つ be し て お り (His611), こ れ を yuan に residual り の residues を tectonic デ ー タ に base づ き be し た. Be さ れ た ア ミ ノ acid を replacement し た - variant コ リ シ ン D を 発 now, refined し, in vitro で の activity を adjustment べ た results, Lys608 を - different さ せ た - variant コ リ シ ン D が the し い active low の を shown し た. <s:1> と と ら, Lys608が residue <s:1> active center residue であると test えられる. (2) コ リ シ ン E5 や D の 応 の established by use of method コ リ シ ン お よ び イ ン ヒ ビ タ ー を a 々 に 発 now す る プ ラ ス ミ ド を そ れ ぞ れ as し, HeLa に import し た. こ の cells の タ ン パ ク を synthetic activity, at the same time に import し た プ ラ ス ミ ド よ り 発 now す る ル シ フ ェ ラ ー ゼ の synthetic quantity に よ り review 価 し た. そ の results, wild type コ リ シ ン E5, D を 発 now す る cells で は, the し い タ ン パ ク synthetic low が see ら れ, こ の active は イ ン ヒ ビ タ ー を 発 now total さ せ る こ と に よ り resistance against さ れ た. こ の こ と か ら, animal cells で も, コ リ シ ン E5, D が active を し, ま た, イ ン ヒ ビ タ ー に よ り active の オ ン · オ フ が may で あ る こ と が points か っ た. Now, コリシ <e:1> E5,DをTet is によ を induced to occur るトラ <e:1> スジェニッ <s:1> ウスを ウスを in the process of ウスを operation. こ の マ ウ ス を parsing す る こ と に よ り, tRNA の handicap of に し seaborne て individual レ ベ ル で ど の よ う な disorders が raw じ る か adjustable べ る こ と が may で あ る. ま た, at the same time に コ リ シ ン を ミ ト コ ン ド リ ア に bureau in turn さ せ る こ と に よ り, ミ ト コ ン ド リ ア を ノ ッ ク ダ ウ ン さ せ る を, cell レ ベ ル で building in で あ る.

项目成果

正木春彦, 小川哲弘: "The modes of action of colicins E5 and D, and related cytotoxic tRNases"Biochimie. 84. 433-438 (2002)

Haruhiko Masaki、Tetsuhiro Okawa：“大肠杆菌素 E5 和 D 以及相关细胞毒性 tRNA 的作用模式”Biochimie 84. 433-438 (2002)。