ヒトペプチドトランスポータ(hPEPT)の遺伝子情報を基盤とした薬物療法の確立

基于人类肽转运蛋白（hPEPT）遗传信息的药物治疗的建立

• 批准号: 16790309
• 负责人: 寺田 智祐
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790309/
• 关键词: ペプチドトランスポータ; 転写制御; 発現プロファイル; プロモーター; 小腸; 吸収; 腸上皮化生; Cdx2; 一塩基多型; PEPT1; PEPT2; 経上皮輸送; 薬物輸送; シミュレーション; 速度論解析

ペプチドトランスポータ(PEPT1)は、主に小腸上皮細胞の刷子縁膜に発現し、ジ・トリペプチド、さらにペプチド類似薬物等の吸収を媒介している。PEPT1の発現は様々な因子によって変動することが知られているが、その転写調節に関わる分子機構は不明の点が多い。そこで、PEPT1の転写制御に関する基礎的な知見を得ることを目的として、ヒトPEPT1のプロモーター領域をクローニングし、Caco-2細胞を用いて各種検討を行うとともに、ヒト消化管組織サンプルを用いて、PEPT1 mRNAの発現解析を行った。PEPT1プロモーター領域のdeletion analysisの結果、転写開始部位の上流35から172bp間の領域がPEPT1の転写活性に重要であることが明らかとなった。この領域には基礎転写因子の一つであるSp1が結合すると推定されるGC boxが複数存在した。これら推定Sp1結合サイトにそれぞれ変異を導入することにより転写活性は低下し、また、Caco-2細胞の核抽出液を用いたゲルシフトアッセイにより、推定Sp1結合サイトとSp1の結合が確認された。さらに、PEPT1の転写活性は、Sp1の過剰発現により上昇し、Sp1とDNAとの結合阻害剤であるmithramycin A処理により低下した。これらの結果から、ヒトPEPT1プロモーターのbasal activityにはSp1が複数の結合部位を通して寄与していることが示された。Sp1の発現分布はユビキタスであり、PEPT1の小腸特異的な発現を説明することはできない。そこで、PEPT1の組織特異性を規定する因子の候補として、腸管特異的な転写因子であり、小腸上皮細胞の分化や機能維持に重要な役割を果しているCdx2に着目した。Caco-2細胞でCdx2を過剰発現させた場合、PEPT1のプロモーター活性は顕著に上昇した。さらにCdx2の作用機序について、共発現系、クロマチン免疫沈降法等の検討を加えた結果、Cdx2はSp1と相互作用することによりPEPT1プロモーター領域に作用し、転写を活性化させることが示された。また、ヒトの胃組織(腸上皮化生の検体を含む)におけるPEPT1とCdx2のmRNA発現量は良好な相関を示した。これはPEPT1発現調節におけるCdx2の重要性をin vivoの面からも支持する結果であると考えられる。ヒト消化管サンプルを用いて、PEPT1の発現プロファイルについて調べた。PEPT1は小腸において最も高く発現し、部位別の発現量は十二指腸>空腸>回腸であった。一方、食道、結腸、直腸にはほとんど発現していなかったが、胃では有意な発現が認められた。そこでPEPT1の発現の認められた胃の病理切片を用いてHE染色並びに、上皮細胞の刷子縁膜のマーカーの一つであるCD10の免疫染色を行った。その結果、いずれの組織も腸上皮化生の発生していることが分かり、胃に発現するPEPT1は腸上皮化生に由来することが示された。

肽转运蛋白（PEPT1）主要在小肠上皮细胞的刷边膜上表达，并介导二肽，肽样药物等的吸收。尽管众所周知，PEPT1的表达取决于各种因素，但涉及其转录调控的分子机制尚不清楚。因此，为了获得有关PEPT1转录调控的基本知识，将人类PEPT1的启动子区域克隆，使用CACO-2细胞进行了各种研究，并使用人类胃肠道组织样品进行了PEPT1 mRNA表达分析。对PEPT1启动子区域的缺失分析表明，转录起始位点上游的35至172 bp之间的区域对于PEPT1转录活性很重要。该区域中有多个GC盒子结合SP1，这是基础转录因子之一。通过使用Caco-2细胞的核提取物，通过凝胶移位分析证实了将突变转录到这些假定的SP1结合位点减少了转录活性，并通过凝胶移位测定确认了推定的SP1结合位点和SP1的结合。此外，通过SP1的过表达来增加PEPT1的转录活性，并通过用Mithramycin A的治疗（SP1结合与DNA的抑制剂）减少。这些结果表明，SP1通过多个结合位点有助于人类PEPT1启动子的基础活性。 SP1的表达分布无处不在，无法解释PEPT1的小肠特异性表达。因此，我们专注于CDX2，它是针对肠道特有的转录因子，在分化和维持小肠上皮细胞的分化和维持中起着重要作用，作为定义PEPT1组织特异性的候选因子。当CCACO-2细胞中CDX2过表达时，PEPT1的启动子活性显着增加。此外，对CDX2作用机理的研究包括共表达系统和染色质免疫沉淀方法，其他研究表明，CDX2与SP1相互作用，作用于PEPT1启动子区域并在转录上作用。此外，人类胃组织中PEPT1和CDX2的mRNA表达水平（包括肠化生的标本）显示出良好的相关性。这被认为是支持CDX2从体内的角度调节PEPT1表达的重要性的结果。人类胃肠道样品用于研究pept1的表达谱。 Pept1在小肠中表达最多，duodeNum> jejunum> ileum的表达水平。另一方面，尽管它在食道，结肠或直肠几乎没有表达，但在胃中观察到了显着的表达。因此，使用表达PEPT1的胃病理切片进行染色，并对上皮细胞的刷子边界膜的标记之一进行免疫染色。结果，发现肠上皮上皮症发生在所有组织中，表明在胃中表达的pept1源自肠道化生。

项目成果

腎薬物トランスポータの機能・発現ならびに疾患とSNP解析

肾脏药物转运蛋白的功能和表达、疾病和SNP分析

• 发表时间: 2004
• 期刊: ゲノム医学 4・9
• 作者: 寺田智祐;乾 賢一
• 通讯作者: 乾 賢一

Androgen receptor is responsible for rat organic cation transporter 2 (rOCT2) gene regulation but not for rOCT1 and rOCT3.

雄激素受体负责大鼠有机阳离子转运蛋白 2 (rOCT2) 基因调节，但不负责 rOCT1 和 rOCT3。

• 期刊: Pharm.Res. (In press)
• 作者: 寺田智祐;乾 賢一;Irie et al.;Asaka et al.
• 通讯作者: Asaka et al.

Regulation of diurnal rhythm of intestinal transporters SGLT1 and PEPT1 in food deprived, refed and scheduled fed rats.

食物剥夺、补充和计划喂养大鼠肠道转运蛋白 SGLT1 和 PEPT1 昼夜节律的调节。

• 发表时间: 2004
• 期刊: J.Nutr. 134・9
• 作者: Terada;Inui;Terada et al.;Pan et al.
• 通讯作者: Pan et al.

Expression profiles of various transporters for oligopeptides, amino acids and organic ions along the human digestive tract.

• DOI: 10.1016/j.bcp.2005.09.027
• 发表时间: 2005-12
• 期刊: Biochemical pharmacology
• 影响因子: 5.8
• 作者: T. Terada;Y. Shimada;Xiaoyue Pan;K. Kishimoto;T. Sakurai;R. Doi;H. Onodera;T. Katsura;M. Imamura;K. Inui

Prediction of glycylsarcosine transport in Caco-2 cell lines expressing PEPT1 at different levels.

预测不同水平表达 PEPT1 的 Caco-2 细胞系中甘氨酰肌氨酸的转运。

• 期刊: Pflugers Arch.-Eur.J.Physiol. (In press)
• 作者: 寺田智祐;乾 賢一;Irie et al.
• 通讯作者: Irie et al.