腎臓におけるV1a受容体を介した抗利尿ホルモン作用制御の機序の解明と治療法の研究

阐明肾脏中V1a受体控制抗利尿激素作用的机制及治疗方法的研究

• 批准号: 16790466
• 负责人: 中山 裕史
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790466/
• 关键词: V1a受容体; V2受容体; プロモーター活性; 転写因子; PKC

まずPCRクローニングしたV1a受容体のcDNAを発現ベクターにサブクローニングし、このベクターを培養細胞(LLCPK1)にトランスフェクションした。ベクターの細胞へ導入にはFlip-Inシステムを用い、V1a受容体の恒常的な強制発現を検討した。細胞ではRT-PCR及びウェスタンブロット法にてV1a受容体が強発現していることが確認された。次にラットV2受容体のプロモーターをクローニングし、V1a受容体を強制発現させた培養細胞にトランスフェクションし、プロモーター活性を測定した。この検討でV1a受容体の発現がV2受容体のプロモーター活性を抑制することが判明した。培養細胞に実際にバゾプレッシンを作用させることでV2受容体の発現が制御されることも確認した。この作用はV1a受容体に特異的な拮抗薬にて抑制され、V2受容体の拮抗薬では抑制されず、V2受容体発現が抗利尿ホルモンのV1a受容体を介して直接制御されることが明らかとなった。またプロモーターベクターで30種類以上に及ぶdeletion seriesやmutationを作成し、V2受容体プロモーター活性制御において、V1a受容体による転写活性抑制の責任領域(consensus sequence)の解明を検討した。これにより転写領域の-600bp〜-50bpまでの塩基配列が責任領域であることが明らかとなった。さらに、V1a受容体の情報伝達の下流にはPKCの活性化があり、この情報伝達経路がV2受容体発現を制御している可能性が考えられるため、PKC活性化薬(PMA)及び阻害薬(スタウロスポリン)のV2受容体のプロモーター活性への影響を検討した。V2受容体プロモーターをトランスフェクションした細胞にPMAを作用させるとV2受容体プロモーター活性は約50%に抑制され、さらにスタウロスポリンを追加投与すると、PMAによるプロモーター活性抑制が解除されることが認められた。これら薬剤によるプロモーター活性への作用は用量依存性であった。これらの結果よりV1a受容体及びPKC情報伝達系を介してV2受容体の発現が抑制されることが示唆された。またプロモーター活性の測定に用いる細胞としては、集合尿細管由来の培養細胞を用いるのが理想的であること、また培養細胞としてよりvivoに近い状態を得るため、マウスの腎臓からmicrodissection法を用いてネフロンセグメントを分離し、プライマリーカルチャーを行い、細胞系列の確立にも成功した。

The cDNA of the V1a receptor was detected by PCR and cultured in LLCPK1 cells. In the case of cell culture, Flip-In-System and V1a receptor, the constant stress response is discussed. Cell RT-PCR and DNA sequencing confirmed the presence of V1a receptor. In addition, V2 receptor was stressed and V1a receptor was cultured to determine its activity. This study found that V1a receptor activity was inhibited by V2 receptor activity. The expression of V2 receptor was determined by the method of cell culture. This effect is inhibited by V1a receptor-specific antagonists, and V2 receptor-specific antagonists are also inhibited. It is clear that V2 receptor production is directly controlled by the V1a receptor of the antidiuretic hormone. More than 30 kinds of deletion series mutations are created, V2 receptor activity control is performed, V1a receptor activity control is performed, and the consensus sequence is discussed. This is the first time that we've had a problem with this. In addition, the downstream of V1a receptor information transfer is related to PKC activation, and the possibility of controlling V2 receptor development by this information transfer pathway is examined. The effects of PKC activation agent (PMA) and inhibitor on V2 receptor activation are discussed. V2 receptor activity is inhibited by about 50% and PMA activity is released by adding V2 receptor activity. The effect of the drug on the activity is dose-dependent. As a result, V1a receptors and PKC information transmission systems are inhibited from occurring in V2 receptors. To determine the activity of the urine tubule, we used the cell culture method to isolate the urine tubule and establish the cell series.

项目成果

Regulation of aquaporin-2 by metabolic acidosis

代谢性酸中毒对 aquaporin-2 的调节

• 发表时间: 2004
• 期刊: Am J Physiol Cell Physiol 287
• 作者: Ohkouchi S;Nonoguchi H
• 通讯作者: Nonoguchi H

Long-term renoprotective effect of combination therapy with prostaglandin E1 and angiotensin-converting enzyme inhibitor in patients with chronic renal failure

前列腺素E1联合血管紧张素转换酶抑制剂对慢性肾功能衰竭患者的长期肾脏保护作用

• 发表时间: 2005
• 期刊: Hypertens.Res. 28(9)
• 作者: Nakayama Y;Nonoguchi H
• 通讯作者: Nonoguchi H

Gene regulation of renal-osmotic stress-induced Na-Cl organic solute cotransporter.

肾渗透应激诱导的 Na-Cl 有机溶质协同转运蛋白的基因调控。

• 发表时间: 2004
• 期刊: Nephron Exp Nephrol 96
• 作者: Tuyen do G;Kitamura K;Adachi M;Miyoshi T;Wakida N;Nagano J;Nonoguchi H;Tomita K.;Tuyen do G.;Baba T
• 通讯作者: Baba T

Differential effects of hyperosmolality on Na-K-ATPase and vasopressin-dependent cAMP generation in the medullary thick ascending limb and outer medullary collecting duct.

高渗透压对髓质厚升肢和外髓集合管中Na-K-ATP酶和加压素依赖性cAMP生成的不同影响。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Hypertns. Res. 28
• 作者: Sakuma Y;et al.
• 通讯作者: et al.