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アデノウイルスベクターを用いた造精機能に関わる転写因子DAX1の精巣内遺伝子導入

使用腺病毒载体将参与精子发生的转录因子 DAX1 进行睾内基因转移

基本信息

批准号：
16790923
负责人：
小島祥敬
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790923/
关键词：
転写因子男子不妊症遺伝子導入

项目摘要

1.アデノウイルスベクターの調製昨年に引き続きアデノウイルスベクターの調製から始めたが、昨年発現を確認したはずのCV-1に遺伝子導入したDAX-1蛋白の発現が実はうまくいっておらず再度組み換えアデノウイルスの作製からやり直した。COS-TPC法を利用した組換えアデノウィルス作製キットAdenovirus Expression Vector Kit(TaKaRa Code 6150)を用いて行った。コスミドベクターにDax1遺伝子を含むプラスミドを挿入したのち構造を確認し大量調製を行った。組換えアデノウイルスを作製し、構造を確認したのち力価を測定した。ウイルス液は5%FCS及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMを用い、10^9pfu/mlのウイルス液を10mlに調製した。作製したアデノウイルスベクターをCV-1に遺伝子導入しDax-1蛋白の過剰発現をウエスタンブロティングにより確認した。2.培養細胞への遺伝子導入マウスセルトリ細胞(TM4)を培養しDax-1を遺伝子導入したが、培養細胞への毒性が強いためか、細胞がほとんど死滅した。ウイルス液の濃度を10^6〜10^8pfu/mlまで振って再度培養細胞への遺伝子導入を試みたが、細胞の毒性が強いと判断した。そのため、作製したアデノウイルスベクターに組み込んだプラスミドベクターが良くないと判断し、現在プラスミドベクターのプロモーターを変更し、再度アデノウイルスベクターの作製を試みた。

1. The expression of DAX-1 protein in CV-1 protein was confirmed by the detection of DAX-1 protein in DAX-1 protein. COS-TPC method is used to make Adenovirus Expression Kit(TaKaRa Code 6150). Dax1 is the most important part of the system. The structure of the structure is determined. 5% FCS and 10% DMEM The gene expression of Dax-1 protein was confirmed by PCR. 2. Culture of cells and gene transfer into cells (TM4) culture Dax-1 gene transfer, culture of cells and toxicity, cell death The concentration of the solution was 10^6 ~ 10^8 pfu/ml, and it was determined that the cytotoxicity of the re-cultured cells was strong. In addition, it is necessary to make a decision on the selection of the best selection.