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ポストゲノム時代に対応する人工制限酵素の開発

后基因组时代人工限制性内切酶的开发

基本信息

批准号：
16750140
负责人：
須磨岡淳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度開発した1本鎖DNAを塩基配列特異的に切断する人工酵素が、バイオテクノロジーのツールとして実際に応用が可能であるかについて検討した。今回は、遺伝子組み換えを行うターゲット長鎖DNAとして、GFP遺伝子およびBFP遺伝子を選択した。これは、GFP遺伝子とBFP遺伝子との間で、わずか数アミノ酸が異なるだけであり、さらには同じアミノ酸をコードしているがコドンが異なる部分があるために、目的の組換え操作の実証には最適と判断したからである。まず、人工制限酵素を用いてGFP遺伝子をターゲット部位で切断し、この断片と別途調製したBFP遺伝子の一部とをリガーゼを用いて結合し、組換えDNAを調製した。塩基配列を確認したところ、目的の組換えDNAが調製されていることが確認された。さらに、この組換えDNAを大腸菌に導入し、BFPの発現に関しても確認した。これら結果は、今回開発した人工制限酵素が、遺伝子工学やゲノム機能解析などの次世代ツールとして、有効であることを強く示唆するものである。また、より高活性な人工制限酵素を構築するために、 Ce(IV)によるリン酸ジエステル結合の切断のメカニズムについて検討を行った。Ce(IV)が均一な低いpH条件での動力学的な解析の結果、 Ce(IV)は単独で働くのではなく、複核のクラスターを形成し、これがリン酸ジエステル加水分解に主要な役割を果たしていることが明らかになった。この結果は、生理条件下においても、Ce(IV)がクラスターで作用していることを強く示唆するものである。従って、より高活性な人工制限酵素の開発のためには、Ce(IV)を多核で含むような錯体の構築が必須であることが明らかになった。

The development of a novel DNA sequence that is specific to the DNA sequence in this gene sequence may result in the development of a novel DNA sequence that is specific to the DNA sequence. Now, the gene group is going to have to change the DNA sequence, GFP sequence and BFP sequence. For example, if you want to change your password, you can change your password. A part of the GFP gene is cut off, fragmented and modulated by artificial restriction enzymes, and a part of the GFP gene is combined and modulated by DNA. The DNA sequence of the target gene was confirmed. The introduction of DNA into E. coli and the development of BFP were confirmed. The result is that artificial restriction enzymes, genetic engineering, and functional analysis of the next generation are now being developed. High activity artificial restriction enzyme construction, Ce(IV), acid binding and cleavage Ce(IV) is a homogeneous low pH condition. The kinetic analysis results show that Ce(IV) is independent of the pH value, and the formation of Ce(IV) and Ce(IV) is independent of the pH value of Ce (IV). The results show that Ce(IV) can be used as an indicator under physiological conditions. The development of high activity artificially restricted enzymes is necessary for the construction of polynuclear enzymes.