ポストゲノム時代に対応する人工制限酵素の開発

后基因组时代人工限制性内切酶的开发

基本信息

批准号：
16750140
负责人：
須磨岡淳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度開発した1本鎖DNAを塩基配列特異的に切断する人工酵素が、バイオテクノロジーのツールとして実際に応用が可能であるかについて検討した。今回は、遺伝子組み換えを行うターゲット長鎖DNAとして、GFP遺伝子およびBFP遺伝子を選択した。これは、GFP遺伝子とBFP遺伝子との間で、わずか数アミノ酸が異なるだけであり、さらには同じアミノ酸をコードしているがコドンが異なる部分があるために、目的の組換え操作の実証には最適と判断したからである。まず、人工制限酵素を用いてGFP遺伝子をターゲット部位で切断し、この断片と別途調製したBFP遺伝子の一部とをリガーゼを用いて結合し、組換えDNAを調製した。塩基配列を確認したところ、目的の組換えDNAが調製されていることが確認された。さらに、この組換えDNAを大腸菌に導入し、BFPの発現に関しても確認した。これら結果は、今回開発した人工制限酵素が、遺伝子工学やゲノム機能解析などの次世代ツールとして、有効であることを強く示唆するものである。また、より高活性な人工制限酵素を構築するために、 Ce(IV)によるリン酸ジエステル結合の切断のメカニズムについて検討を行った。Ce(IV)が均一な低いpH条件での動力学的な解析の結果、 Ce(IV)は単独で働くのではなく、複核のクラスターを形成し、これがリン酸ジエステル加水分解に主要な役割を果たしていることが明らかになった。この結果は、生理条件下においても、Ce(IV)がクラスターで作用していることを強く示唆するものである。従って、より高活性な人工制限酵素の開発のためには、Ce(IV)を多核で含むような錯体の構築が必須であることが明らかになった。

我们研究了去年开发的单链DNA的人工酶实际上是否可以用作生物技术工具。在本文中，选择GFP和BFP基因作为遗传修改的靶标长链DNA。这是因为GFP和BFP基因之间只有几个氨基酸不同，并且有些部分编码相同的氨基酸但具有不同的密码子，因此确定它对于证明所需的重组程序是最佳的。首先，使用人工限制酶在目标位点上裂解GFP基因，并使用连接酶结合了该片段和一部分分别制备的BFP基因以制备重组DNA。当确认基本序列时，已经制备了重组DNA的确认。此外，将此重组DNA引入大肠杆菌中，并确认了BFP的表达。这些结果强烈表明，这次开发的人工限制酶是用于基因工程和基因组功能分析的下一代工具。此外，为了构建更活跃的人工限制酶，研究了CE（IV）磷酸二键键裂解的机理。在均匀的低pH条件下，CE（IV）的动力学分析表明，CE（IV）不单独工作，而是形成一组二核，该核酸群在磷酸盐二酯水解中起主要作用。该结果强烈表明，即使在生理条件下，CE（IV）即使在簇中也有效。因此，已经揭示了为了开发更活跃的人工限制酶，必须以多核方式构造包含CE（IV）的复合物。