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ポストゲノム時代に対応する人工制限酵素の開発

后基因组时代人工限制性内切酶的开发

基本信息

批准号：
16750140
负责人：
須磨岡淳
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度開発した1本鎖DNAを塩基配列特異的に切断する人工酵素が、バイオテクノロジーのツールとして実際に応用が可能であるかについて検討した。今回は、遺伝子組み換えを行うターゲット長鎖DNAとして、GFP遺伝子およびBFP遺伝子を選択した。これは、GFP遺伝子とBFP遺伝子との間で、わずか数アミノ酸が異なるだけであり、さらには同じアミノ酸をコードしているがコドンが異なる部分があるために、目的の組換え操作の実証には最適と判断したからである。まず、人工制限酵素を用いてGFP遺伝子をターゲット部位で切断し、この断片と別途調製したBFP遺伝子の一部とをリガーゼを用いて結合し、組換えDNAを調製した。塩基配列を確認したところ、目的の組換えDNAが調製されていることが確認された。さらに、この組換えDNAを大腸菌に導入し、BFPの発現に関しても確認した。これら結果は、今回開発した人工制限酵素が、遺伝子工学やゲノム機能解析などの次世代ツールとして、有効であることを強く示唆するものである。また、より高活性な人工制限酵素を構築するために、 Ce(IV)によるリン酸ジエステル結合の切断のメカニズムについて検討を行った。Ce(IV)が均一な低いpH条件での動力学的な解析の結果、 Ce(IV)は単独で働くのではなく、複核のクラスターを形成し、これがリン酸ジエステル加水分解に主要な役割を果たしていることが明らかになった。この結果は、生理条件下においても、Ce(IV)がクラスターで作用していることを強く示唆するものである。従って、より高活性な人工制限酵素の開発のためには、Ce(IV)を多核で含むような錯体の構築が必須であることが明らかになった。

Last year, we launched the first artificial enzyme, DNA-locking DNA ligation-specific に-cutting enzyme.オテクノロジーのツールとして実间に応用がpossibleであるかについて検検曰した. This time は, the remaining 伝子组みchangeえを行うターゲット长 lockDNAとして, the GFP remaining 伝子およびBFP the remaining 伝子を选択した.これは, GFP缝子とBFP缝子との间で, わずか数アミノ acidがisoなるだけであり, さらには同じアミノ acidをコードしているがコドンがdifferent なる PART があるために、 The purpose of the combination and operation is to prove that it is optimal and to judge.まず、Artificial restriction enzyme をUsing いてGFP leftover parts をターゲットでcut off し、このfragments and other ways Modulation of the BFP left 伝子の一とをリガーゼを is combined with いて, and the combination of DNA is modulated. The base arrangement is confirmed, and the target combination is DNA modulated, and the DNA is modified and confirmed.さらに, このgene replacement えDNA を coliform に introduction し, BFP の発appears に关してもconfirmation した.これらRESULTは、This time Kailuしたartificial restriction enzymeが、缝子工学やゲノムfunctional solution Analyze the next generation ツールとして, and the effective であることを强く时憆するものである.また, より Highly active な artificial restriction enzyme を constructed するために, Ce(IV)によるリン acid ジエステル合のメカニズムについて検椒行った. Analytical results of the kinetics of Ce(IV) under uniform and low pH conditions, Ce(IV)は単多で働くのではなく、reviewのクラスターを成し、これがリThe main ingredient of ジエステル is decomposed by adding water.このRESULTS は、Under physiological conditions においても、Ce(IV)がクラスターで Effect していることをSTRONG く Shows するものである. Ce(IV)をMulti-core でContains むようなError body のConstruction がであることが明らかになった.