基質認識に基づいた特異性の高い自殺基質の分子設計

基于底物识别的高特异性硅化物底物的分子设计

• 批准号: 17780072
• 负责人: 奥山 正幸
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780072/
• 关键词: 自殺基質; 糖質分解酵素; 基質認識; デキストラナーゼ

構造プロテオミクス、プロテオーム解析など網羅的なタンパク質の機能解析の一方で、各論的な分子機能解析も今後の重要な課題となる。本研究の目的は分子機能解析の一環としての自殺基質を用いた糖質関連酵素の活性中心の一般的な探索法の開発である。自殺基質(EAG)は、酵素が基質を認識する機構を考慮した糖分子と反応基にはカルボキシ基と反応性の高いエポキシ環を用い、これら二つの分子群の距離をアルキル基鎖長を増減することで調節し、より特異性の高い自殺基質を設計した。酵素失活の分子機構解析に関しては失活が自殺基質的であることを反応動力学的に実証した。応用例も開発した。1.自殺基質の失活反応の解析;自殺基質の効果を解析するモデル酵素としてisomalto-dextranaseを用いた。アルキル基の長さ(炭素数3-6)が異なる自殺基質(E3G〜E6G)を混合し阻害効果を調べた。各自殺基質(EAG)濃度で失活の擬一次速度定数を求め、EAG濃度に対して擬一次速度定数をプロットすると両者の関係は直線ではなく飽和曲線となりMichaelis-Menten型の失活反応を示すことがわかった。すなわち失活はメカニカルベースであることがわかった。またE5Gの二次速度定数は他のEAGの6倍から10倍高くなっており、アルキル基の鎖長が自殺基質としての能力に重要なファクターであることがわかった。2.EAGを用いたα-amylase活性の特異的測定法;EAG利用の応用として生物試料破砕液からα-amylase活性を特異的に測定する方法の開発を試みた。β-amylase阻害剤E4Gとα-glucosidase阻害剤CBEをα-amylase:β-amylase:α-glucosidase混液と混合し後者二酵素を特異的に失活させ、α-amylaseのみの活性測定に成功した。このことは酵素を精製することなく粗酵素液中などで特定の酵素を失活させることができること示している。またこの結果は標識した自殺基質を用いて修飾後、ペプチドマスフィンガープリントなどにより、粗酵素液でも特定の酵素の活性中心のアミノ酸配列を知ることができるツールに成り得る可能性を示している。3.自殺基質との複合体立体構造の解析については期間内に解析を完了することはできなかった。現在も引き続き進行中である。

Tectonic プ ロ テ オ ミ ク ス, プ ロ テ オ ー ム parsing な ど snare of な タ ン パ ク qualitative analytical の の function side で な molecules, the theory of functional analytic も の な important topics in future と な る. の purpose this study は molecular function analytical part の と し て の を suicide matrix with い た sugar masato の even enzyme active center の な exploration method commonly の open 発 で あ る. が suicide matrix (EAG) は, enzyme substrate を know す る institutions を consider し た sugar molecule と anti 応 に は カ ル ボ キ シ base と anti 応 の high い エ ポ キ シ ring を い, こ れ ら two つ の molecular group of の distance を ア ル キ ル base lock long を rights reduce す る こ と で し adjustment and よ り high specificity の い suicide matrix を design し た. Analysis of the <s:1> molecular mechanism of enzyme inactivation に related て て inactivation が suicide matrix である <s:1> とを anti-応 kinetics に practical evidence of た た. Youdaoplaceholder0 use case た development た. 1. Analysis of the inactivation reaction of suicidal matrix 応 応; The effect of suicide matrix を analysis するモデ て enzyme と て isomalt-dextranase を is used in た た. Youdaoplaceholder0, キ, キ, さ matrix length さ(carbon content 3-6)が different なる suicide matrix (E3G ~ E6G)を mixed <s:1> inhibition effect を adjustment べた. The suicide matrix (EAG) concentration で inactivation の proposed a speed limit を め, concentration of EAG に し seaborne て proposed a speed limit を プ ロ ッ ト す る と struck is の masato is は linear で は な く saturation curve と な り Michaelis - Menten の inactivation against 応 を shown す こ と が わ か っ た. Youdaoplaceholder0 inactivation メカニカ メカニカ ベ ベ スである スである とがわ とがわ った った. ま た E5G の secondary speed constant は he の EAG 6 times の か ら 10 times as high く な っ て お り, ア ル キ ル base の lock long が suicide matrix と し て の に important な フ ァ ク タ ー で あ る こ と が わ か っ た. 2.EAGを is determined by a <s:1> specific method of α-amylase activity; EAG using の 応 with と し て biological sample 砕 breaking liquid か ら を alpha amylase activity determination of specific に す る method の open 発 を try み た. Beta amylase resistance against tonic E4G と alpha glucosidase resistance against one of the CBE を alpha amylase: beta amylase: alpha と glucosidase mixed liquid mixed し the latter two enzyme inactivation を specific に さ せ, alpha amylase の み の activity determination に successful し た. こ の こ と は enzyme を refined す る こ と な く thick enzyme fluid in な ど で specific の enzyme inactivation を さ せ る こ と が で き る こ と shown し て い る. ま た こ の results は logo し た を suicide matrix with い て after modification, ペ プ チ ド マ ス フ ィ ン ガ ー プ リ ン ト な ど に よ り, thick enzyme fluid で の も の specific enzyme activity center の ア ミ ノ acid with column を know る こ と が で き る ツ ー ル に into り risk る を shown し て い る. 3. Suicide matrix と の complex three-dimensional structure analytical に の つ い て は に during the parse finished を す る こ と は で き な か っ た. Now 続 続 である in progress である.

项目成果

Purification and characterization of the hyper-glycosylated extracellular α-glucosidase from Schizosaccharomyces pombe

• DOI: 10.1016/j.enzmictec.2004.06.018
• 发表时间: 2005-10-03
• 期刊: ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY
• 影响因子: 3.4
• 作者: Okuyama, M;Tanimoto, Y;Chiba, S
• 通讯作者: Chiba, S

Molecular analysis of α-glucosidase belonging to GH-family 31.

属于 GH 家族 31 的 α-葡萄糖苷酶的分子分析。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biologia 60-S16
• 作者: Nakai H;Okuyama M;Kim Y-M;Saburi W;Wongchawalit J;Mori H;Chiba S;Kimura A
• 通讯作者: Kimura A

Multiple forms of α-glucosidase in rice seeds (Oryza sativa L., var Nipponbare)

• DOI: 10.1016/j.biochi.2006.09.014
• 发表时间: 2007
• 期刊: Biochimie
• 影响因子: 3.9
• 作者: Hiroyuki Nakai;Tatsuya Ito;M. Hayashi;Koutarou Kamiya;Takeshi Yamamoto;K. Matsubara;Young-Min Kim;Wongchawalit Jintanart;M. Okuyama;H. Mori;S. Chiba;Y. Sano;A. Kimura

Glucoamylase originating from Schwanniomyces occidentalis is a typical α-glucosidase

源自西方雪旺酵母的葡糖淀粉酶是典型的α-葡萄糖苷酶

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biosci. Biotechnol. Biochem. 69
• 作者: Uemura;M.;H. Nakai;河村 幸男;S. Bozonnet;重松 智美;F. Sato
• 通讯作者: F. Sato

デキストラン生成酵素遺伝子、デキストラン生成酵素およびその製造方法、デキストランの製造方法

葡聚糖产生酶基因、葡聚糖产生酶及其生产方法、葡聚糖生产方法

• 发表时间: 2005