1残基のアミノ酸置換で「糖質分解酵素を多糖合成酵素に変換」する現象の分子機構

单氨基酸取代“碳水化合物降解酶转化为多糖合酶”现象的分子机制

• 批准号: 20658025
• 负责人: 木村 淳夫
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20658025/
• 关键词: アミノ酸置換; 糖質分解酵素; 多糖合成酵素

1残基のアミノ酸置換で「多糖の加水分解酵素(デキストラナーゼ)を合成酵素に転換できる現象」を見出した。この反応機構を分子解析することが、本申請の目的である。このような合成反応は例がなく、世界で初めての現象である。また、産業利用への発展にも期待したい。この残基は触媒アミノ酸と考えられる。本現象は試験管内の観察であるが、このような点突然変異した酵素が実際に生物で機能している可能性を得た。進化の過程においてアミノ酸置換は容易に生じ、1つのアミノ酸を変異させることで酵素分子を「加水分解→合成」にする戦略は、進化的に効率が良い。この戦略の検証も本申請の目的である。本年度は次の結果を得た。多糖合成の分子解析(デキストラナーゼ):1)酵素の結晶化と立体構造解析:昨年度に大量精製した親酵素とGly置換体を用いて結晶化条件を検討した。良好な結晶化条件を確定でき、X線構造解析を進行中である。2)他のアミノ酸による変異酵素:Asp→Gly置換体が合成反応を示したが、より効率の良いアミノ酸置換も想定されたため、他の残基への点変異を試みた。その結果、Gly置換体が最も高い反応効率を与えた。Glyは最もサイズの小さな残基であり、Asp→Gly置換で生じた大きな空間が重要と考えられた。すなわち、このサイズの大きい空間に陰イオンが侵入し合成反応が進行したと考えられた。3)陰イオンの解析:アザイドイオンが最も反応効率の良い陰イオンであった。従って本イオンのサイズ・強度が合成反応に最適であることが分かった。反応の至適pHを確定でき、pK_a値に大きな変化がないと予想できた。4)生成物の構造解析:生成多糖はデキストラン様の構造であった。触媒残基の変異酵素の解析(ウニ酵素):5)遺伝子の発現:酵素遺伝子の異種宿主発現を行った。酵素蛋白質は封入体を形成せず発現しているが、塩存在下であっても酵素活性が極めて低かった。

1 residue の ア ミ ノ acid replacement で "polysaccharide の hydrolysis enzyme (デ キ ス ト ラ ナ ー ゼ) を synthetic enzyme に planning in で き る phenomenon" を see out し た. <s:1> 応 anti-応 institution を molecular analysis する とが とが purpose of the present application である. <s:1> ような ような synthetic inverse 応 example がなく, world で initial めて である phenomenon である. Youdaoplaceholder0, industrial utilization of へ へ, development of に に, and anticipation of た た また. <s:1> residue catalyst ア ノ acid と examination えられる. This phenomenon は test tube の 観 examine で あ る が, こ の よ う な point suddenly - different し た enzyme が be interstate に biological function of で し て い た を る possibility. Evolution process of の に お い て ア ミ ノ acid replacement は easy に じ, 1 つ の ア ミ ノ acid を - different さ せ る こ と で enzyme molecule を "hydrolytic decomposition and synthesis" に す る 戦 slightly は, evolution に sharper rate が い "good". The purpose of this application is である. The を result of を times this year is た. Polysaccharide synthesis の molecular resolution (デ キ ス ト ラ ナ ー ゼ) : 1) enzyme の crystallization と three-dimensional structure analytic: yesterday's annual に lots of refined し た pro enzyme と を Gly replacement body with い て crystallization conditions を beg し 検 た. Good な crystallization conditions を determine で な, X-ray structural analysis を ongoing である. 2) he の ア ミ ノ acid に よ る - isoenzymes, Asp, Gly replacement body が synthetic anti 応 を shown し た が, よ り good working rate の い ア ミ ノ acid replacement も scenarios さ れ た た め, he の residues へ の point - try different を み た. Youdaoplaceholder0 そ results, the Gly permutation が has the highest <s:1> anti応 efficiency を and えた. Gly は most も サ イ ズ の small さ な residues で あ り, Asp, Gly replacement で raw じ た big き な space が important と exam え ら れ た. Youdaoplaceholder0, <s:1> サ サ ズ ズ ズ ズ <s:1> large <s:1> サ space に Yin <s:1> <s:1> <e:1> が が が が が intrusion <s:1> synthesis reverse 応が conduct <s:1> たと examination えられた. 3) Analysis of Yin Yin Yin Yin Yin であった :アザ ド Yin Yin Yin <e:1> が most <s:1> anti-応 efficiency <s:1> good アザ Yin Yin であった であった. Youdaoplaceholder0 this <s:1> が サ サ ズ ズ · intensity が synthetic inverse 応に optimal である とが とが fraction った. Anti 応 の to optimum pH を determine で き, pK_a numerical に big き な variations change が な い と to think で き た. 4) Analysis of the particle structure of the product: The particle structure of the generated polysaccharide デキストラ デキストラ is であった. Analysis of catalytic residue homologous enzymes (ウニ enzymes):5) occurrence of 伝 seed enzymes: heterologous hosts of enzyme 伝 seed enzymes exhibit を rows った. The enzyme protein <s:1> entrapment body を forms せず, <s:1> て るが るが るが, and in the presence of salt, the であって enzymatic activity が is extremely めて and った った.

项目成果

オオムギβ-アミラーゼの澱粉粒への吸着および分解に関する研究

大麦β-淀粉酶对淀粉颗粒吸附分解的研究

• 发表时间: 2009
• 作者: 小川進也;吉村悦郎;Kim YM;Hondoh H;Okuyama M;Kang MS;Mori H;Hondoh H;Okuyama M;Saburi W;Kim YM;Funane K;Kitamura M;奥山正幸;寺田智明;貞廣樹里;田上貴祥;舟根和美;Kang HK;藤本瑞;原口慶子
• 通讯作者: 原口慶子

α-1,3グルコシド結合に高い特異性を示すα-glucosidaseの取得

获得对 α-1,3 糖苷键具有高特异性的 α-葡萄糖苷酶

• 发表时间: 2009
• 作者: Tamegai;H.;Ota;Y.;Haga;M.;Fujimori;H.;Kato;C.;Nogi;Y.;Kawamoto;J.;Kurihara;T.;and Sambongi;Y;小林和之
• 通讯作者: 小林和之

Catalytic mechanism of retainingα-galactosidase belonging to glycoside hydrolase family 97.

属于糖苷水解酶家族97的保留α-半乳糖苷酶的催化机制。

• 发表时间: 2009
• 期刊: J. Mol. Biol. 392
• 作者: Okuyama M;Kitamura M;Hondoh H;他5名
• 通讯作者: 他5名

Structural comparison of Streptococcus mutans dextran glucosidase with glucoside hydrolases in GH13

变形链球菌葡聚糖葡萄糖苷酶与 GH13 中葡萄糖苷水解酶的结构比较

• 发表时间: 2009
• 期刊: J Appl Glycosci VOL.56
• 作者: 梅川碧里;ら;Hondoh H
• 通讯作者: Hondoh H

環状イソマルトオリゴ糖グルカノトランスフェラーゼの結晶構造解析

环状异麦芽低聚糖葡聚糖转移酶的晶体结构分析

• 发表时间: 2010
• 作者: 栗山浩一;吉田謙太郎;藤本瑞
• 通讯作者: 藤本瑞