未分化維持遺伝子が誘導する体細胞核再プログラム化機構の解明

阐明未分化维持基因诱导的体细胞核重编程机制

• 批准号: 17790190
• 负责人: 下崎 康治
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790190/
• 关键词: ES細胞; 核再プログラム化; 未分化維持遺伝子; 幹細胞; 細胞融合

ES細胞特異的に発現するFbx15の欠損マウス胸腺細胞とES細胞とを電気的に細胞融合させ、G418による薬剤選択によって出現するコロニー数からES細胞のリプログラミング効率を測定した結果、約0.5%であることが分かった。またEGFPトランスジェニックマウス胸腺細胞と、野生型ES細胞、Nanogを導入したES細胞、及びNAT1欠損ES細胞とを細胞融合させFACS解析を行い、その融合効率を測定した結果、平均融合率は約10%であるのに対し、リプログラミング効率はNAT1欠損細胞及びNanog強制発現ES細胞は野生株に比べて約2.5倍の高さで胸腺細胞を再プログラムすることが明らかとなった。そこで核再プログラム化に関与する遺伝子解明のため、発現クローニングを試みた。まずNAT1欠損ES細胞からmRNAを抽出し、レトロウィルスベクターを骨格としたcDNAライブラリーを構築した。これを精巣由来細胞に感染導入した後、G418による薬剤選択を行った。残念ながら遺伝子導入による核再プログラム化を引き起こす遺伝子はこの実験系では検出できなかったが、この結果から核再プログラムは複数の遺伝子と協調的に行われていると想定できる。興味深いことに、ES細胞ではマスターレギュレーターとしてOct3/4、Nanog、Sox2の遺伝子群が深く関与していることが他研究グループよりCell誌に報告されたが、我々は精巣由来細胞及び、成体脳海馬領域由来神経幹細胞においてはこれらの遺伝子だけではES細胞に再プログラムされないことを実験的に確かめている。つまり、これらの遺伝子にプラスαの遺伝子が必須であることが想定されるため、構築したcDNAライブラリーをOct3/4、Nanog、Sox2を発現させた体細胞に導入し、同様な薬剤選択によるスクリーニングを行う予定である。

细胞特异性表达的小鼠胸腺细胞和ES细胞与FBX15缺陷型小鼠胸腺细胞电融合，并根据G418执行药物选择时出现的菌落数来测量ES细胞的重编程效率，并发现其约为0.5％。 Furthermore, FACS analysis was performed to fuse EGFP transgenic mouse thymocytes with wild-type ES cells, Nanog-transduced ES cells, and NAT1-deficient ES cells, and FACS analysis was performed to measure the fusion efficiency, and it was found that while the average fusion rate was about 10%, the reprogramming efficiency of NAT1-deficient cells and Nanog-expressing ES cells reprogram胸腺细胞比野生菌株高2.5倍。因此，试图阐明参与核重编程的基因。首先，从NAT1缺乏的ES细胞中提取mRNA，并使用逆转录病毒载体作为主链构建cDNA文库。在感染并将其引入睾丸来源的细胞后，使用G418选择了该药物。不幸的是，在该实验系统中未检测到通过基因转移引起核重编程的基因，但是从此结果可以假设，核重编程是与多个基因合作进行的。有趣的是，其他研究小组在Cell的杂志上报道说，Oct3/4，Nanog和Sox2基因组作为ES细胞中的主要调节剂深深地参与了ES细胞的主要调节剂，但我们已经通过实验证实，仅这些基因不能在睾丸来源的细胞中重编程为ES细胞，并且来自成人脑脑海马区域的神经干细胞中的神经干细胞。换句话说，由于假定具有阳性α的基因对于这些基因是必不可少的，因此构造的cDNA文库将被引入表达Oct3/4，Nanog和Sox2的体细胞中，并且将使用相同的药物选择进行筛选。