C型肝炎ウイルス治療薬の新規スクリーニングシステムの構築

丙型肝炎病毒治疗药物新型筛选体系的构建

• 批准号: 17790308
• 负责人: 團迫 浩方
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790308/
• 关键词: C型慢性肝炎; EGFP; 全長HCV RNA複製細胞; 適応変異; スクリーニング; インターフェロン; 治癒細胞

C型慢性肝炎患者に対する治癒率の改善のためには、現在のインターフェロン(IFN)とリバビリンの併用療法の改善だけでなく、IFNよりもC型肝炎ウイルス(HCV)の排除に効果的な薬剤をスクリーニングすることも重要である。そこで、従来のシステム(レポーター蛋白質の酵素活性を利用し、細胞内のHCV RNA複製レベルを定量、しかし生細胞のままの定量は困難)より簡便かつ安価に大規模な薬剤スクリーニングを遂行するために、緑色蛍光蛋白質であるEGFPをレポーター蛋白質に用いて、生細胞のままHCV RNA複製レベルの定量を可能にするシステムの開発を試みた。前年度までに、このシステムに必要なEGFP遺伝子を含む全長HCV RNA複製細胞を数クローン樹立することができ、細胞内でのHCV蛋白質およびEGFPの発現や、EGFPによる蛍光は観察できている。今年度は、この樹立した全長HCV RNA複製細胞を用いて、生細胞のままHCV RNA複製レベルを定量できるシステムの構築を行った。樹立できた数クローンのうち、OGN/C-5B/KE細胞(EGFP遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子の前に、また適応変異としてNS3領域にK1609Eのアミノ酸置換を導入した全長HCV RNAが持続的に複製している細胞)のあるクローンが最も効率よく経時的に蛍光強度を上昇していることが確認できた。この細胞にIFN-αを処理し、その蛍光強度を生細胞のまま測定したところ、IFN-αの濃度依存的に減少していた。また、その値は、リアルタイムPCR法により定量したHCV RNA量と相関していた。また、ウエスタンブロット法により、EGFPやHCVコア蛋白質も減少していることが確認された。IFN-α以外に、HCVの排除に効果を示すことが報告されているIFN-β、IFN-γ、シクロスポリンAやフルバスタチンを同様に処理したところ、その蛍光強度とHCV RNA量の値は相関していた。また、IFN-αとシクロスポリンAあるいはIFN-αとフルバスタチンの併用処理は、それぞれの単剤処理に比べ、その蛍光強度は減少していた。これらの結果は、生細胞のままHCV RNAの複製レベルを定量することができるシステムを開発することができ、また、種々の薬剤処理も可能であることを示している(今研究実績は、現在、投稿準備中である)。

The improvement of cure rate in patients with chronic hepatitis C is mainly due to the combination therapy of IFN and HCV. This is a simple and easy way to implement a large-scale HCV replication project. It is difficult to quantify HCV RNA replication in living cells. It is possible to quantify HCV RNA replication in living cells. In the past year, the EGFP gene has been necessary for the establishment of full-length HCV RNA replication cells, and the development of HCV protein and EGFP in cells has been observed. This year, we established full-length HCV RNA replicating cells for use in vitro and in vivo to quantify HCV RNA replication. OGN/C-5B/KE cells (EGFP gene expression, resistance gene expression, gene mutation, NS3 domain, K1609E gene expression, acid substitution, full-length HCV RNA expression, replication, cell culture) were established and the light intensity increased at the time of optimal efficiency. The IFN-α concentration dependent decrease was determined by measuring the light intensity of these cells. HCV RNA quantification by PCR It is confirmed that EGFP HCV protein is reduced by the method of " IFN-β, IFN-γ and HCV RNA levels are correlated with each other. In addition, IFN-α and IFN-α were used in combination to reduce the intensity of light. These results indicate that HCV RNA replication in living cells can be quantified, and that there is a need to develop a system for the treatment of HCV RNA.

项目成果

Efficient replication of a full-length hepatitis C virus genome, strain O, in cell culture, and development of a luciferase system.

在细胞培养物中有效复制全长丙型肝炎病毒基因组 O 株，并开发荧光素酶系统。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemical and Biophysical Research Communications 329・4
• 作者: Kameoka;Masanori;Yukiko Kitagawa;Ken-ichi Abe;Ken-ichi Abe;Masanori Ikeda;Hiromichi Dansako;Masanori Ikeda
• 通讯作者: Masanori Ikeda

Cell culture-adaptive NS3 mutations required for the robust replication of genome-length hepatitis C virus RNA

• DOI: 10.1016/j.virusres.2006.12.011
• 发表时间: 2007-04-01
• 期刊: VIRUS RESEARCH
• 影响因子: 5
• 作者: Abe, Ken-ichi;Ikeda, Masanori;Kato, Nobuyuki
• 通讯作者: Kato, Nobuyuki

Hepatits C virus proteins exhibit conflicting effects on the interferon system in human hepatocyte cells.

丙型肝炎病毒蛋白对人肝细胞中的干扰素系统表现出相互矛盾的作用。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Biochemical and Biophysical Research Communications 336・2
• 作者: Kameoka;Masanori;Yukiko Kitagawa;Ken-ichi Abe;Ken-ichi Abe;Masanori Ikeda;Hiromichi Dansako;Masanori Ikeda;Kazuhito Naka;Hiromichi Dansako
• 通讯作者: Hiromichi Dansako

Development of a new cell-based assay for monitoring HCV RNA replication level with living cells.

开发一种新的基于细胞的检测方法，用于监测活细胞 HCV RNA 复制水平。

• 期刊: (発表予定)
• 作者: Kameoka;Masanori;Yukiko Kitagawa;Ken-ichi Abe;Ken-ichi Abe;Masanori Ikeda;Hiromichi Dansako;Masanori Ikeda;Kazuhito Naka;Hiromichi Dansako;Kazuhito Naka;Ken-ichi Abe;Hiromichi Dansako;Hiromichi Dansako
• 通讯作者: Hiromichi Dansako

Serum-free cell culture system supplemented with lipid-rich albumin for hepatitis C virus (strain O of genotype 1b) replication.

• DOI: 10.1016/j.virusres.2006.12.015
• 发表时间: 2007-05
• 期刊: Virus research
• 影响因子: 5
• 作者: K. Abe;M. Ikeda;Y. Ariumi;H. Dansako;N. Kato