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骨髄幹細胞から心筋細胞への分化過程における分子機構の解明

阐明骨髓干细胞向心肌细胞分化过程的分子机制

基本信息

批准号：
17790947
负责人：
李桃生
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790947/
关键词：
骨髄幹細胞心筋分化再生医学

项目摘要

骨髄幹細胞はin vitro及びin vivoで心筋細胞へ分化すると報告されている。最近、我々はex vivoでTGF-β添加培養により骨髄幹細胞からmyosin陽性心筋様細胞へ分化誘導することに成功した。本研究では骨髄幹細胞から心筋細胞へ分化する過程の分子機構の解明と分化した心筋細胞の機能の解析を目的とした。C57/BL6マウス大腿骨から骨髄細胞を採集し、比重遠心法を用いて単核球細胞を分離した。また、c-kit陽性幹細胞はMagnetic cell sorterにより骨髄単核球細胞から分離採集した。分離した骨髄幹細胞(純度90%以上)は15%FBS添加RPMI1640培地にてfibronectin-coated culture dishで培養した。TGF-β_1(5 ng/ml)を添加培養した骨髄幹細胞は培養後1〜3日目からGATA-4,Nkx2.5のmRNA発現が著明に上昇し始め、14日目までには心筋細胞に特異的な構造蛋白Troponin-1,Troponin-T, connexinの発現もRT-PCR法で確認できた。また、培養後28日目に、TGF-β_1を添加培養した骨髄幹細胞はより効率的にmyosin, Troponin-I, connexin陽性細胞に分化誘導できたことが免疫染色で認められた。TGF-β_1を添加培養した骨髄幹細胞は電気刺激下で一部の細胞に弱いCa^<2+> Transientが培養2〜4週間に認められたが、自律的な収縮はなかった。さらに、Oligo GEArray^<(R)> Mouse TGFβ-BMP Signaling Pathway Microarrayを用いた解析ではTGF-β_1を添加培養した骨髄幹細胞にSmad-2,Smad-3,c-fos, TSC-22などの発現が明らかに上昇した。TGF-βはSmad-2,Smad-3,c-fos, TSC-22などの転写を活性化し、骨髄幹細胞から心筋様細胞への分化を誘導した。しかし、骨髄幹細胞から完全に成熟した機能的な心筋細胞への分化には至らなかった。

Bone marrow stem cells are in vitro and in vivo, and the differentiation of cardiac muscle cells is reported. Recently, we have successfully induced the differentiation of myosin-positive cardiac muscle cells by ex vivo TGF-β addition culture. The purpose of this study was to elucidate the molecular mechanisms involved in the differentiation of bone stem cells and cardiac muscle cells and to elucidate their functions. C57/BL6- C-kit positive stem cells were isolated and collected from bone marrow by Magnetic cell sorter. Isolated bone marrow stem cells (purity> 90%) were cultured in a fibronectin-coated culture dish supplemented with 15% FBS and RPMI1640. TGF-β_1(5 ng/ml) was added to the culture of bone marrow stem cells. The mRNA expression of GATA-4, Nkx2.5 increased significantly from day 1 to day 3 after culture. The expression of Troponin-1,Troponin-T, connexin, which is specific to bone marrow stem cells, was confirmed by RT-PCR at day 14 after culture. 28 days after culture, TGF-β_1 was added to the culture of bone marrow stem cells to induce differentiation of myosin, Troponin-I, connexin-positive cells. TGF-β_1 was added to the culture of bone marrow stem cells. Some of the cells were weak in Ca^<2+> Transient under electrical stimulation. After 2 ~ 4 weeks of culture, the cells were recognized and self-regulated. Mouse TGF-β-BMP Signaling Pathway Microarray was used to analyze TGF-β_1 in culture of bone marrow stem cells, Smad-2,Smad-3,c-fos, TSC-22, and the development of Smad-2,Smad-3,c-fos, TSC-22. TGF-β activation of Smad-2,Smad-3,c-fos, TSC-22 and induction of differentiation of skeletal stem cells and cardiac muscle cells. Bone stem cells are fully mature and functional and differentiate into muscle cells.