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先天性筋無力症におけるアセチルコリンレセプターαのsplicing異常の解析

先天性肌无力乙酰胆碱受体α剪接异常分析

基本信息

批准号：
17700347
负责人：
増田章男
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17700347/
关键词：
スプライシング PTBP1 HnRNP-H 筋無力症 AChR MS2 遺伝子 RNA 神経科学

项目摘要

AChRのαサブユニットをコードする遺伝子CHRNA1上のinframe exonであるP3Aのalternative splicingを制御する因子の同定および機能解析を行った。P3Aのalternative splicingを生じるαIVS3-8G→A mutationを解析した。変異配列とその前後15merを含んだoligo DNA(計31mer)およびその対象として同一部位の正常配列より、in vitro transcription法によりBiotin標識したUTPを取り込ませながらprobe RNAを合成した。HEK293細胞より抽出した核タンパクとprobeを混合し、probeと核タンパクを結合させた。このRNA/蛋白複合体をstreptavidineビーズにより精製し、結合蛋白をWestern blotting法により同定したところ、probeには、スプライシング制御因子であるPTBP1とHnRNP-Hが結合することが判明した。特に、HnRNP-Hは変異配列で結合が著明に減弱していた。次に、HnRNP-Hと特定の配列RNAに結合することが知られているMS2coat proteinの融合タンパク(MS2-HnRNP-H)発現プラスミドを作成した。変異部位にMS2結合配列を挿入したminigeneを作成し、Hela細胞にMS2-HnRNP-H発現プラスミドと共にtransfectionした。RNAを回収し、P3Aのスプライスパターンの変化を確認したところ、MS2-HnRNP-H発現によりP3A exon inclusionが著明に減少した。以上により、αIVS3-8G→Amutationは、HnRNP-H結合部位を破壊し、HnRNP-Hが機能しなくなるため、alternativesplicingを引き起こすことが判明した。

AChR α-splicing gene CHRNA1 frame exon P3A alternative splicing gene control factor identity function analysis P3A and alternative splicing are generated. αIVS3-8G→A mutation is analyzed. 15mer before and after heteroalignment including oligo DNA(total 31mer) and the opposite of normal alignment in the same site, in vitro transcription method, Biotin identification, UTP, and probe RNA synthesis HEK293 cells were extracted from the nucleus and probe was mixed. The RNA/protein complex was purified by streptavidine and bound to protein by Western blotting, and the binding factors were identified by PTBP1 and HnRNP-H. Special, HnRNP-H heterosexual alignment, bright and weak In addition, HnRNP-H binds to specific alignment RNA, and the fusion protein of MS2 coat protein (MS2-HnRNP-H) is known to be produced. MS2-HnRNP-H expression in Hela cells was detected by PCR. RNA recovery, P3A exon inclusion, and MS2-HnRNP-H discovery were identified. Amutation, αIVS3-8G→Amutation, HnRNP-H binding site, HnRNP-H function, alternative splicing