in situ cDNA増幅による超高感度 RNA-蛋白 相互作用 解析法の開発

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研究代表者が開発した効率的RNA-タンパク相互作用検出法 (tRIP法) をベースに、各実験ステップの改変を行うことで、さらなる効率化法を探索した。i) マルチプレックス化への検討。random primer部位とindex部位を持つoligo DNAをconjugationしたRBP特異抗体を使用したマルチプレックス化の適正条件について検討した。Conjugation時の至適抗体/DNA量や結合反応条件の検討を行い、効率的なconjugationに成功した。さらに、得られた抗体を用いてRNA結合タンパクFUSに対するFUS-tRIP libraryの作製ができることを確認した。ii)固定法の改善： 細胞内RNA-タンパク相互作用の固定に、tRIP法ではUVクロスリンクを利用していたが、ホルムアルデヒドへの代替可能性を探索した。DNA-タンパク相互作用解析法であるChIP法では、生細胞に対し1%ホルムアルデヒドを用いて10分常温での固定が一般的である。我々は、ホルムアルデヒド濃度・反応温度・反応時間の検討を行い、RNA-タンパク相互作用の固定には、同様のバッファーで室温2分で十分なことを見出した。iii)細胞内クロマチン分画回収法の構築。スプライシングや3' end proceccing factor制御をはじめとするRNA代謝制御RNA結合タンパクのほとんどが細胞内クロマチン分画に分布している。しかし、クロマチン分画にはDNAおよび様々な核内タンパクが高密度に集積しており、そこから効率的に目的タンパクを回収することは、困難であった。我々は、今回、その改良に取り組み、抽出液の塩濃度を急激に変化させることでクロマチン分画が沈殿可能であり、その沈殿から効率的にRNAを回収する方法の確立に成功した。