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in situ cDNA増幅による超高感度 RNA-蛋白相互作用解析法の開発

开发使用原位 cDNA 扩增的超灵敏 RNA-蛋白质相互作用分析方法

基本信息

批准号：
22K19269
负责人：
増田章男
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19269/
关键词：
RNA-タンパク相互作用 CLIP tRIP RNA結合タンパク RNA代謝

项目摘要

研究代表者が開発した効率的RNA-タンパク相互作用検出法 (tRIP法) をベースに、各実験ステップの改変を行うことで、さらなる効率化法を探索した。i) マルチプレックス化への検討。random primer部位とindex部位を持つoligo DNAをconjugationしたRBP特異抗体を使用したマルチプレックス化の適正条件について検討した。Conjugation時の至適抗体/DNA量や結合反応条件の検討を行い、効率的なconjugationに成功した。さらに、得られた抗体を用いてRNA結合タンパクFUSに対するFUS-tRIP libraryの作製ができることを確認した。ii)固定法の改善：細胞内RNA-タンパク相互作用の固定に、tRIP法ではUVクロスリンクを利用していたが、ホルムアルデヒドへの代替可能性を探索した。DNA-タンパク相互作用解析法であるChIP法では、生細胞に対し1%ホルムアルデヒドを用いて10分常温での固定が一般的である。我々は、ホルムアルデヒド濃度・反応温度・反応時間の検討を行い、RNA-タンパク相互作用の固定には、同様のバッファーで室温2分で十分なことを見出した。iii)細胞内クロマチン分画回収法の構築。スプライシングや3' end proceccing factor制御をはじめとするRNA代謝制御RNA結合タンパクのほとんどが細胞内クロマチン分画に分布している。しかし、クロマチン分画にはDNAおよび様々な核内タンパクが高密度に集積しており、そこから効率的に目的タンパクを回収することは、困難であった。我々は、今回、その改良に取り組み、抽出液の塩濃度を急激に変化させることでクロマチン分画が沈殿可能であり、その沈殿から効率的にRNAを回収する方法の確立に成功した。

Research representatives explore the RNA-protein interaction model (tRIP) for developing efficiency and improving efficiency of each species. i) Search for a list of items. random primer site, index site, oligo DNA conjugation, RBP specific antibody, etc. The optimal antibody/DNA amount for conjugation and the optimal conjugation conditions were successfully investigated. The production of FUS-tRIP library was confirmed by RNA binding assay. ii) Improvement of fixation method: To explore the possibility of substitution of UV-RNA by tRIP method for fixation of RNA-RNA interaction in cells. DNA-DNA interaction analysis method: ChIP method is suitable for 1% growth of cells and 10 min fixation at room temperature. A study of the reaction time, reaction temperature, reaction time, reaction time, iii) Construction of intracellular DNA sequencing method. RNA metabolism controls the distribution of RNA in cells. It is difficult to collect DNA and DNA from nuclear materials at high density. We have successfully established a method for the recovery of RNA from the extract by rapidly changing the concentration of the extract.