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ホスホペプチド非依存性トリパノソーマ14-3-3の認識機構の解明および治療への応用

阐明锥虫14-3-3的不依赖磷酸肽的识别机制及其治疗应用

基本信息

批准号：
18590410
负责人：
井上雅広
金额：
$ 2.57万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18590410/
关键词：
トリパノソーマ 14-3-3 リン酸化ペプチドシグナル伝達

项目摘要

18年にS/TxxxxxxS/TxxxS/T motifとの結合を予測しhumanTelomeraseとの結合をhuman 14-3-3tauとT.brucei(トリパノソーマ原虫)14-3-3IおよびIIで検討したが、どちらも優位な結合は認められなかった。さらにFatty acid elongaseおよびPP2Aのregulatory subunitなどとの結合をほ乳類293T細胞およびトリパノソーマ原虫に、HAtagおよびV5Tagを付加して発現させたをimmunoprecipitation法あるいはGST-pulldown法にて検討するも強い結合は認めなかった。19年度、私は大腸菌にて14-3-3のheterodimerの発現精製に成功した。そのheterodimerをトリパノソーマ原虫から抽出したタンパクおよび293T細胞より抽出したタンパクを用いたFar-Western blotに用いると、phosphatase inhibitorであるcalculinA処理後でT.brucei 14-3-3結合タンパクの量およびレパートワーの増加を認めた。このことは、私が予測していた「トリパノソーマ原虫の14-3-3タンパクがリン酸化非依存性に働く」という命題を否定するものとなった。すなわち今まで主にhomodilmerとして働いていると考えられてきた14-3-3タンパクがトリパノソーマ原虫の場合、おもにheterodimerとしてリン酸化タンパクに結合して働いていることが考えられる。この現象は、ほ乳類、酵母、植物を通して初めての発見である。この新規heterodimer14-3-3タンパクを用いリン酸化ペプチドとの結合をドットブロット法にて検討すると、驚いたこと既存のmode1, mode2, mode3のペプチドと結合しないことが判明した。さらにトリパノソーマphosphatase PP2Cをほ乳類293T細胞にV5Tagを付加し発現させた細胞をもちい,その細胞抽出液を抗V5Tag抗体にてimmunoprecipitationしたものをさらにFar-westernblot法にて検出すると、heterodimerトリパノソーマ14-3-3タンパクとの結合を認めた。現在、詳細なモチーフについて検討中である。現時点でのdataはトリパノソーマ原虫特有の14-3-3タンパク結合能のあるリン酸化ペプチドが創薬の基盤になることを示唆する。

In 18 years, S/TxxxxS/TxxxS/T motif and its combination were predicted. Human Telomerase and its combination were predicted. Human 14-3-3tau and T.brucei(T.brucei)14-3-3I and II were discussed. In addition, Fatty acid elongase and PP2A regulatory subunit are combined with HATG 293T cell receptor and HATG V5Tag to develop immunoprecipitation method, GST-pulldown method and GST-pulldown method. In 2019, the development and purification of heterodimer from Escherichia coli was successfully completed. T.brucei 14-3-3 binding activity was increased after treatment with phosphokinase inhibitor and protein inhibitor by Far-Western blot. This is the first time I have ever seen such a situation. The main homodilmer is composed of 14-3-3 heterodimer and 14-3 heterodimer. This phenomenon is related to milk, yeast and plants. The new heterodimer14-3-3 is used to determine the combination of mode1, mode2 and mode3. In addition, the expression of V5Tag in human breast 293T cells was detected by immunoprecipitation in all cell extracts, and the expression of V5Tag in human breast 293 T cells was detected by Far-western blot. Now, detailed The data at this point is unique to the protozoan, 14-3-3, and can be combined with the enzyme to create a substrate.