ヒト胚性幹細胞からの心筋分化機構の解明

阐明人胚胎干细胞心肌分化机制

基本信息

批准号：
18890092
负责人：
馬場志郎
金额：
$ 1.69万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

平成20年度は、ヒト胚性幹細胞から分化した心筋が、実際マウスで報告されているように、中胚葉細胞を経て心筋に分化するかどうかを検討した。ヒト胚性幹細胞をOP-9ストローマ細胞上で分化培養すると、分化6日目から中胚葉系マーカーであるFetal Liver Kinase 1(Flk1)陽性細胞が出現する。このFlk1陽性細胞を分離回収することで有効に心筋分化する細胞が得られるか検討した。Flk1陽性細胞の割合は分化8日目から増加し、10日目でも同様の割合で確認された。このFlk1陽性細胞をCell Sorterで分離回収し、さらにOP-9ストローマ細胞上で分化培養させた。一部の細胞は血球系の細胞、内皮シート形態を持ったコロニーに分化した。PCR法ではANF、 MLC2a、 Cardiac Actin、ANPなどの心筋マーカーの発現上昇が見られたが,明らかな心筋収縮は同定されなかった。この原因が細胞をCell Sorterで分離回収する際に細胞を単一細胞にしなければならないために細胞のViability低下が起きる結果と考え、Flk1陽性細胞を回収後にSuspension Cultureで更にEmbryoid Bodyを作製した。この時、細胞増殖を助長するRock Inhibitorを添加した。我々は、このRock Inhibitorを添加することで、単一細胞レベルの未分化ヒト胚性幹細胞が有効にEmbryoid Bodyを形成することを確認している。Rock Inhibitorを添加した培養液中でFlk1陽性細胞は径50-100μm程度のEmbryoid Bodyを形成した。現在、このEmbryoid BodyをさらにゼラチンディッシュまたはOP-9ストローマ細胞上で分化培養し、心筋分化を確認しているところであり、研究を継続中である。

在2008年，我们研究了心肌是否与人类胚胎干细胞通过中胚层细胞区分为心肌，如小鼠报道。当人类胚胎干细胞在OP-9基质细胞上分化时，胎儿肝激酶1（FLK1）阳性细胞（是中胚层标记）从分化的第6天出现。我们研究了分离和收集这些FLK1阳性细胞是否会产生有效分化心肌区分的细胞。 FLK1阳性细胞的比例从分化的第8天开始增加，并在第10天以相同的速率确认。FLK1阳性细胞被分离并使用细胞分子分离，然后在Op-9基质细胞上的分化中培养。一些细胞分化为血细胞，具有内皮薄片形态的菌落。 PCR显示出心肌标记物的表达升高，例如ANF，MLC2A，心肌动蛋白和ANP，但没有发现明显的心肌收缩。人们认为这是原因的原因，导致细胞活力的降低，因为在用细胞分离器分离和收集细胞时，必须将细胞分成单个细胞。收集FLK1阳性细胞后，使用悬浮培养产生了额外的胚胎体。目前，添加了促进细胞增殖的岩石抑制剂。我们已经确认，通过添加这种岩石抑制剂，在单细胞水平上未分化的人类胚胎干细胞有效地形成胚胎体。在加入岩石抑制剂的培养基中，FLK1阳性细胞形成直径约为50-100μm的胚胎体。目前，该胚胎体进一步培养在明胶培养皿或OP-9基质细胞上，以确认心肌分化，并正在继续进行研究。