メンブレントラフィックの調節における低分子量GTP結合蛋白質ARFとRabの共役

Rab 与小 GTP 结合蛋白 ARF 偶联调节膜运输

• 批准号: 07J40052
• 负责人: 高橋 千絵
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J40052/
• 关键词: メンブレントラフィック; FIP3; FIP4; Rabll; ARF6; 細胞質分裂; Arfophilin

リサイクリングエンドソームを介する輸送に関与するRabllと、エンドサイトーシスやアクチン細胞骨格のリモデリングなどのように細胞膜付近で機能するARF6の両方と相互作用するタンパク質FIP3とFIP4は、小胞輸送を調節する上で極めて重要な役割を果たすが、その生理的機能はほとんど不明である。本研究は、2種類の低分子量GTPase(Rab11とARF6)と共役するFIP3とFIP4の機能を分子レベルで解析し、細胞内輸送における役割を解明することを目的としている。本年度は、以下の実験を行い、現在までに興味深い観察結果を得ている。今後はさらに詳細に解析を行い、分子レベルでの機能解明に至ることを期待している。1.ARF.Rabllのドミナント・ネガティブ変異体によるFIP3.FIP4の細胞内局在の変化 FIP3または4の発現によりRabllの局在が安定化されて共局在することがわかった。また、Rabllのドミナント・ネガティブ体の発現によりFIP3の局在が大きく変化することも認められた。2.FIP3およびFIP4特異的抗体の作製FIP3およびFIP4とGSTとの融合タンパク質を大腸菌で作製し、それらを抗原としてウサギに免疫し、血清を回収し、特異抗体を得た。ウェスタンブロッティングでは有用であったが、免疫染色には反応しなかったので、現在、抗原箇所を変えて再度作製を試みている。3.RNAi法によるFIP3とFIP4のノックダウンノックダウンの至適条件を確認することができた。4.Yeast Two Hybrid法による結合蛋白質の検索Yeast two hybrid法を用いたFIP3およびFIP4結合タンパク質としていくつかの有力な候補を得た。GST-Pulldownn法等を用いて結合の確認をしている。また、結合領域を絞るための欠損変異体を作製し始めている。5.細胞質分裂時におけるFIP3およびFIP4の局在EGFP-FIP3,EGFP-FIP4などを発現させたHeLa細胞を用いて、細胞質分裂時におけるFIP3,FIP4の挙動をタイムラプス・イメージングで観察している。FIP3,FIP4は分裂時には2つの細胞の中心体付近に一旦局在し、その後細胞間の橋上構造に局在することが観察された。今後は、分裂時のRabllやARF6の局在、FIP3,4の挙動との関連や、各種変異体やRNAiによる挙動変化の観察をする予定である。

蛋白质FIP3和FIP4与RABLL相互作用，它们参与回收内体介导的转运，而在细胞膜附近起作用的ARF6，例如肌动蛋白细胞骨架的内吞作用和重塑，在调节囊泡运输方面起着至关重要的作用，但它们的生理功能是有效的。这项研究旨在分析FIP3和FIP4的功能，这些功能与两种类型的低分子量GTPase（RAB11和ARF6）在分子水平上结合在一起，并阐明了它们在细胞内转运中的作用。今年，我们进行了以下实验，并获得了迄今为止有趣的观察结果。我们希望将来将进行进一步的详细分析，并将在分子级阐明该功能。 1。通过Arf.rabll的主要负突变体对Fip3.fip4的亚细胞定位变化，发现Fip3或4的表达稳定和共定位的Rabll定位。还观察到，Rabll的主要负体体的表达显着改变了FIP3的定位。 2。创建FIP3和FIP4特异性抗体。在大肠杆菌中制备了Fip3和Fip4和GST的融合蛋白，并用兔子作为抗原免疫，并收集血清以获得特定的抗体。尽管它在蛋白质印迹方面很有用，但对免疫染色没有反应，因此我们目前正在尝试通过更改抗原来重新创建抗原部位。 3。我们能够使用RNAi方法确认FIP3和FIP4敲低敲低的最佳条件。 4。通过酵母搜索结合蛋白两种混合方法，使用酵母两种混合方法获得了一些潜在候选物作为FIP3和FIP4结合蛋白。使用GST-Pulldownn方法等确认结合。此外，还开始产生有缺陷的突变体以缩小结合区域。 5。使用表达EGFP-FIP3，EGFP-FIP4等的HeLa细胞在细胞因子过程中的FIP3和FIP4定位，通过延时成像观察到fip3和fip4在细胞因子过程中的行为。观察到FIP3和FIP4在两个细胞的中心体附近的分裂中进行定位，然后将其定位于细胞之间的上方结构。将来，我们计划在分裂过程中观察Rabll和ARF6的定位，与Fip3和4的行为的关系以及由各种突变体和RNAi引起的行为变化。

项目成果

Recruitment of Tom1L1/Srcasm to endosomes and the midbody by Tsg1O1

Tsg1O1 将 Tom1L1/Srcasm 招募到内体和中体

• 发表时间: 2008
• 期刊: Cell Structure and Function 33(in press)
• 作者: Yanagida-Ishizaki;Y.;et. al.
• 通讯作者: et. al.