構造解析に基づくLINE型レトロトランスポゾンの転移機構の解明

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前年度の結果に基づき、カイコ由来のLINEであるSART1のORF2pのC末のZnフィンガードメインを削ったもの(ΔC)の精製を進めた。タンパク質からの核酸の除去はうまくいったものの、十分な量が取れないこととアグリゲーションを起こしやすいことから、結晶化や限定分解によるドメインマッピングなど当初予定していた解析に持ち込むことは困難であった。そのほかに、C末のZnフィンガードメインのみの発現系も構築し精製を試みたが、発現レベル自体が非常に低かった。次にLINE型レトロトランスポゾンの標的配列特異性を明らかにするために、カイコ由来のTRAS1のORF2pN末に存在するエンドヌクレアーゼドメインと標的DNAとの複合体の結晶化を試みた。前年度までに2,8Åのデータが得られていたが、DNA分子は確認できなかった。両端にG:C配列を入れてDNAの安定性を高める工夫を行ったところ、最大2.0Åまで分解能が向上した。高分解能データのおかげでDNAの電子密度が認められたが、占有率が低いためDNA分子をモデリングするのは困難であった。DNA一分子にタンパク質二分子結合しており、予想外の相互作用であった。DNAの占有率を高めるため、タンパク質のディスオーダー領域を削ってみたが改善されなかった。更なるDNA配列の工夫を要すると思われる。LINE型レトロトランスポゾンであるR1Bmのエンドヌクレアーゼドメインについては、構造および機能解析のデータをまとめ、6月に核酸専門国際誌に論文が掲載された。R1Bmについても同様に標的DNAとの複合体結晶化を試みたが成功しなかったので、浸潤法による複合体結晶に向けてDNAのデザインを進めている。