骨格筋におけるカルパインシステムの役割と制御機構の解析

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1.二重変異マウスの解析プロテアーゼ活性のみを失活させたp94を発現するノックインマウス(p94:KI)マウスとコネクチンmdm変異マウスを掛け合わせて二重変異マウスを作製した。mdm変異マウスでは,下記MARPsの発現量上昇が認められる筋繊維タイプに関して,他の筋疾患とは異なる傾向が認められた。二重変異マウスでのMARPsの発現変化及び局在を解析中である。2.コネクチン,MARPsの分解様式についての解析Sf-9細胞に発現させたp94(野生型及び活性減弱変異体)の解析・及び酵母プロテアーゼトラップ法を用いた変異体スクリーニングにより,活性に重要な残基群を特定した。同定した活性減弱型変異体には,カルシウム感受性以外には限りなく野生型p94に近い酵素としての性質を示すものがあった。一方,p94・コネクチン・MARPの共発現系で,コネクチンがp94の基質となりうると同時にp94の構造安定化効果を持ちうること,MARPとp94がコネクチン結合タンパク質として競合的な関係にあることを示唆する結果を得た。また,野生型とmdm変異型コネクチンの性質を比較し,mdm変異は,p94に対する安定化作用の喪失,及び,p94の酵素活性に対する阻害,の2つの影響を持つことを示す結果を得た。3.基質検索及び活性化スペクトルの解析COS細胞に野生型p94または不活性なp94:C129S変異体を発現し,それぞれの細胞グループにおけるタンパク質の量的変化を解析すると,p94の自己消化の様子(分子の全体が速やかに減少していく)と基質と考えられるタンパク質の量的変化(そのタンパク質に由来するペプチドの一部が特に減少する)に違いが見出される。このことに関連して,p94の自己消化活性に及ぼす様々なイオンの影響を比較すると,自己消化と基質分解の過程におけるp94の構造変化に違いがあることが示唆された。