新規の葉緑体タンパク質分解系:RCB経路の分子機構

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本研究では、窒素転流機構と光合成機能維持の両面から植物の生長に深く関わる老化葉における葉緑体タンパク質の分解機構について分子レベルで明らかにすることを目的とし、本年度は以下の2項目について実験を行った。(1)RCB経路に関わるプロテオーム解析先に確立した葉緑体移行GFP発現シロイヌナズナと共焦点レーザー顕微鏡を用いたRCBの生葉における可視化法を用いて、RCBが蓄積した液胞を単離し、これとRCBが蓄積していない液胞を2次元電気泳動に供し、両者で差異の見られるポリペプチドのスポット群を特定することを試みた。まずRCBを含む液胞を単離する方法について検討した。RCBを形成させた葉からセルラーゼとペクチナーゼを用いた酵素法によりプロトプラストを単離した。その後、プロトプラストを破砕し液胞を遊離させた後、パーコールによる密度勾配超遠心法により液胞を単離した。単離した液胞にはRCBの存在が確認された。しかし、液胞画分には少量ながら葉緑体の混入が認められた。よってRCBのプロテオーム解析を行うためにはさらなる精製方法の確立が必要であることがわかった。(2)ストロミュール形成変異体の選抜葉緑体移行GFP発現シロイヌナズナの種子にEMS処理を行い、突然変異体のプールを作成した。この中からストロミュールの形成に異常の見られる変異体を共焦点レーザー顕微鏡により選抜する方法を確立した。17000個体のM2植物から、複数の変異個体を得た。さらに得られた変異個体について戻し交配、異なるエコタイプとの交配を進め、原因遺伝子同定のための材料を整備した。