小児固形腫瘍の分子病理診断法の標準化

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本研究は,小児期に好発する固形腫瘍の分子病理学的診断を標準化することにより,診断の精度向上,迅速化をはかることを目的とした。神経芽腫の予後層別化因子であるMYCN増幅判定におけるホルマリン固定パラフィン切片(FFPE)を用いたChromogenic in situ hybridization(CISH)法の有用性を検討した。神経芽腫細胞より作製したFFPEにてMYCNプローブを用いたCISH法を行い,MYCNシグナルを検出することが可能であった。FISH(fluorescence in situ hybridization)法のほうが感度は良好で,染色体数をカウントできるプローブが存在するなどの利点があり,現時点では,FISH法をまず行うべきと考えられた。一方,CISH法でも組織構築の解析が容易などの利点もあり,腫瘍成分が少ない場合,腫瘍細胞の構成に多様性がある場合は,CISH法を併用したほうが良いと考えられた。また,CISH法における最適な固定時間,固定方法を検討した。その結果,20%中性緩衝ホルマリンで良好な感度が得られること,一晩〜二日間の固定では良好な結果が得られるが,それ以上固定するとシグナルが低下するが,7日間の固定でも薄いシグナルが得られることが判明した。Ewing肉腫細胞を用いて作製したFFPEにてEWSプローブを用いたCISHを行った。CISH法では判定可能であったが,2種類のシグナルが比較的近い色(赤,褐色)であるため,CISH法におけるシグナルの色をより判別しやすくするよう他発色法を検討中である。Ewing肉腫のキメラ遺伝子解析のためのRT-PCR法を行う最適な条件を検討した。MMuLV由来逆転写酵素において最も良好な結果が得られた。5種類ある融合遺伝子に現時点で最適と考えられるプロープを用いたPCR法のプロトコールを作成した。