多機能ライブイメージング法の開発とその細胞生物学研究への応用

多功能活体成像方法的发展及其在细胞生物学研究中的应用

• 批准号: 07F07148
• 负责人: 永井 健治
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07F07148/
• 关键词: FRET; 分子イメージング; 顕微鏡; 可視化

生体分子の機能を可視化するために波長の異なる2つの蛍光分子間で起こるFRET(ヘテロFRET)を利用した様々なプローブが近年開発されている。これらのFRETプローブは観察するための波長が広域であるため、他の蛍光プローブと同時に可視化することが難しい。そこで同一蛍光色分子間で生じるホモFRETを原理とするカルシウムセンサーW-cameleonを作成し、Ca^<2+>の有無での蛍光異方性を測定することが本研究の柱の1つである。今年度は昨年度作成したW-cameleonに様々な変異を導入することでダイナミックレンジの拡大化を行った。その結果、Ca^<2+>センサードメインであるCalmodulin内に蛍光タンパク質を挿入することで、より大きなダイナミックレンジを有するプローブを得ることに成功した。次に、作成したホモFRETプローブの蛍光異方性変化を顕微鏡下で高感度に観察するために、昨年度までに構築した蛍光偏光顕微鏡に改良を加えた。具体的には一片が5μm程度のフォトニック結晶製波長板と偏光板を組み合わせて、マルチアレー化した偏光解消補償板を開発し、対物レンズの後側焦点面に導入することで、高い消光比を得ることに成功した。これにより、対物レンズによる入射光の偏光解消が緩和され、僅かな蛍光異方性変化をも顕微鏡下で捉えることが可能になった。さらに、本蛍光偏光顕微鏡を用いて、W-cameleon、PKC-γ-dsRed、MARCS-mseCFPを発現する培養細胞における3つの現象、すなわちリガンド刺激に伴うCa^<2+>濃度変化とPKC-γの核膜移行、ならびにMARCSの細胞質移行を同時に捉えることに成功した。

The function of biological molecules can be visualized at different wavelengths, and the use of FRET(FRET) between molecules has been developed in recent years. This is the first time I've ever seen a person The principle of FRET is used to determine the optical anisotropy of Ca^<2+> and Ca^<2+>. This year's W-cameleon was created to increase the number of visitors. The result is that the Ca^<2+> content of the Ca2 + solution is very high, and the Ca2 + solution is very high. Second, the preparation of FRET optical anisotropy under the microscope, the construction of optical polarization microscope Specifically, a crystal wavelength plate of about 5μm and a polarizing plate are assembled, and the polarization compensation plate is opened, and the rear focal plane of the object is introduced. The polarization of incident light is relaxed, and the anisotropy of incident light is reduced. In addition, the phenomenon of PKC-γ-dsRed and MARCS-mseCFP in cultured cells was successfully detected by using polarized light microscope, W-cameleon, and MARCS-mseCFP.

项目成果

大口径ファイバー白色光源を用いた高速共焦点顕微鏡の開発と評価

大直径光纤白光源高速共焦显微镜的研制与评价

• 发表时间: 2007
• 期刊: 顕微鏡 42
• 作者: 齊藤健太;谷知己;小林健太郎;永井健治
• 通讯作者: 永井健治

Two-photon excitation behavior of thiophene-based oligomeres and a polymer. n press, 2008

噻吩基低聚物和聚合物的双光子激发行为。

• 发表时间: 2009
• 期刊: Journal of Nanoscience and Nanotechnology 9
• 作者: Yamamoto T;Kumagai A;Saito K;Nagai T.
• 通讯作者: Nagai T.

Deciphering enigma of biological function by a genetically-encoded molecular spy

基因编码的分子间谍破解生物功能之谜

• 发表时间: 2009
• 作者: 林文;他;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;Takeharu Nagai
• 通讯作者: Takeharu Nagai

群青色蛍光タンパク質

群青荧光蛋白

• 发表时间: 2007

A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS restriction enzyme. 137 : 1-7, 2008

使用 DNA 聚合酶抑制剂和 IIS 型限制性内切酶对粗 PCR 产物进行高通量单管重组。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Journal of Biotechnology 137
• 作者: Kotera I;Nagai T
• 通讯作者: Nagai T