完全定量1分子共鳴エネルギー移動測定によるタンパク質構造動態解析法の確立

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本研究は、1タンパク質レベルにおけるFRETのエネルギー移動効率とドナー・アクセプター分子間の相対角度の測定を同時に行う技術を開発し、タンパク質の立体構造変化を解析する手法を確立することが目的である。今年度は、calmodulinタンパク質のN末端とC末端にCy3、Cy5などの蛍光団を標識したものを作成し、昨年度に構築した1分子デフォーカス顕微鏡の評価を行った。またCa2+指示薬カメレオンYC3.60の2次元結晶をガラス基板上に固定し、Ca2+の有無における蛍光異方性の変化から立体構造変化を解析する手法の確立も行った。また、本研究では1分子蛍光観察が必要であるが、従来の蛍光タンパク質では光安定性が悪く、観察中に素早く褪色してしまい、長時間の観察を行うことが不可能であった。そこで、GFPをタンデムに連結することで、蛍光強度を上げる戦略ならびに、光安定性が極めて高い新規蛍光タンパク質の開発も同時に行った。その結果、報告されている蛍光タンパク質の中で最も短波長の蛍光 (424nm) を発する群青色蛍光タンパク質Siriusを開発することに成功した。SiriusはEBFP比で約60倍の光安定性を有するのみならず、その蛍光強度がpH耐性であるという特徴を有していた。さらに、Siriusの蛍光スペクトルがCFPの吸収スペクトルと大きく重なることから、SiriusからCFPへの高効率なFRETが起こる可能性が考えられた。そこで、SiriusとCFPの融合タンパク質を作成したところ、予想通り比較的効率良くFRETが起こることを確認することができた。