完全定量1分子共鳴エネルギー移動測定によるタンパク質構造動態解析法の確立

利用完全定量单分子共振能量转移测量建立蛋白质结构动力学分析方法

基本信息

  • 批准号:
    19042001
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 3.84万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2007
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2007 至 2008
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究は、1タンパク質レベルにおけるFRETのエネルギー移動効率とドナー・アクセプター分子間の相対角度の測定を同時に行う技術を開発し、タンパク質の立体構造変化を解析する手法を確立することが目的である。今年度は、calmodulinタンパク質のN末端とC末端にCy3、Cy5などの蛍光団を標識したものを作成し、昨年度に構築した1分子デフォーカス顕微鏡の評価を行った。またCa2+指示薬カメレオンYC3.60の2次元結晶をガラス基板上に固定し、Ca2+の有無における蛍光異方性の変化から立体構造変化を解析する手法の確立も行った。また、本研究では1分子蛍光観察が必要であるが、従来の蛍光タンパク質では光安定性が悪く、観察中に素早く褪色してしまい、長時間の観察を行うことが不可能であった。そこで、GFPをタンデムに連結することで、蛍光強度を上げる戦略ならびに、光安定性が極めて高い新規蛍光タンパク質の開発も同時に行った。その結果、報告されている蛍光タンパク質の中で最も短波長の蛍光 (424nm) を発する群青色蛍光タンパク質Siriusを開発することに成功した。SiriusはEBFP比で約60倍の光安定性を有するのみならず、その蛍光強度がpH耐性であるという特徴を有していた。さらに、Siriusの蛍光スペクトルがCFPの吸収スペクトルと大きく重なることから、SiriusからCFPへの高効率なFRETが起こる可能性が考えられた。そこで、SiriusとCFPの融合タンパク質を作成したところ、予想通り比較的効率良くFRETが起こることを確認することができた。
This study aims to develop a simultaneous technique for measuring the relative angle between molecules of FRET and to establish a method for analyzing the three-dimensional structure of FRET. This year, the N-terminal and C-terminal of the calmodulin molecule were identified and evaluated. Ca2 + indicator, YC3.60, two-dimensional crystal, fixed on the substrate, Ca2 +, optical anisotropy, three-dimensional structure, and analysis method. In this study, it is necessary to observe the light of 1 molecule, and it is impossible to observe the light stability of 1 molecule, and it is impossible to observe the light of 1 molecule for a long time. For example, GFP is a new type of light source, and the light intensity is increased. The results show that the shortest wavelength of ultraviolet light (424nm) in the middle of the spectrum is successfully developed. Sirius has about 60 times the light stability of EBFP ratio, and the characteristics of pH tolerance. For example, Sirius has a high CFP absorption rate and a high FRET. For example, Sirius and CFP have the ability to create and compare FRET.

项目成果

期刊论文数量(49)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
大口径ファイバー白色光源を用いた高速共焦点顕微鏡の開発と評価
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    齊藤健太;谷知己;小林健太郎;永井健治
  • 通讯作者:
    永井健治
新規の光変換蛍光蛋白質プローブを用いた生体イメージングと動態解析
使用新型光转换荧光蛋白探针进行生物成像和动态分析
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    松田知己;永井健治
  • 通讯作者:
    永井健治
Engineering fluorescent proteins to visualize and manipulate biological functions
工程荧光蛋白以可视化和操纵生物功能
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Tomisaka;Y. ; Nomoto;A. ; Ogawa A.;Fumi Nagatsugi;Takeharu Nagai;小松紘一(代表);永次史;Takeharu Nagai
  • 通讯作者:
    Takeharu Nagai
蛍光・化学発光タンパク質を利用して何ができるか?
我们可以用荧光和化学发光蛋白做什么?
  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    川口真一;小川昭弥;他3名;桑原俊介;永井健治
  • 通讯作者:
    永井健治
群青色蛍光タンパク質
群青荧光蛋白
  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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    2008
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    20059018
  • 财政年份:
    2008
  • 资助金额:
    $ 3.84万
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  • 批准号:
    18655004
  • 财政年份:
    2006
  • 资助金额:
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  • 财政年份:
    2006
  • 资助金额:
    $ 3.84万
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  • 批准号:
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  • 财政年份:
    2005
  • 资助金额:
    $ 3.84万
  • 项目类别:
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