Development of a method for super-resolved chromophore-assisted laser inactivation

本研究の目的は、光の回折限界よりも小さい微小領域においてタンパク質や生体分子複合体等の不活性化を行う超解像光照射分子不活性化技術（SR-CALI）を開発することである。具体的な研究実施項目は、励起光照射下の試料中の微小領域で活性酸素種を発生させるためのタンパク質（SR-CALIタンパク質）の開発、SR-CALIのための超解像顕微鏡装置の開発、そして細胞中の微小領域においてSR-CALIが起こることを確認してそのコンセプトを実証することである。本研究で開発するSR-CALIタンパク質は、活性酸素種を発生可能なON状態と発生できないOFF状態の2状態をとり、これらの状態間の可逆的なスイッチングを光照射で制御（光スイッチング）可能なタンパク質である。今年度は、昨年度開発した光照射分子不活性化スクリーニング法を用いてSR-CALIタンパク質の開発を進めた。今年度試作したSR-CALIタンパク質の分子デザインは、(1)光スイッチング能の無い従来型の活性酸素種発生タンパク質（CALIタンパク質）にアミノ酸変異を導入することで光スイッチング能が付与されたSR-CALIタンパク質（1分子型SR-CALIタンパク質）、そして(2)従来の光スイッチング能を持たないCALIタンパク質に光スイッチング蛍光タンパク質を融合してフェルスター・エネルギー移動（FRET）を介して光スイッチング能が付与されたSR-CALIタンパク質（FRET型SR-CALIタンパク質）の2種類である。これらのうち1分子型SR-CALIタンパク質は作成が難しいことが分かったため、FRET型SR-CALIタンパク質の作成を進めた。FRET型SR-CALIタンパク質のFRETドナーとなる光スイッチング蛍光タンパク質の作成に成功したので、これとCALIタンパク質との融合タンパク質の試作を行っているところである。

本研究の目的は、光の回折限界よりも小さい微小領域においてタンパク質や生体分子複合体等の不活性化を行う超解像光照射分子不活性化技術（SR-CALI）を開発することである。具体的な研究実施項目は、励起光照射下の試料中の微小領域で活性酸素種を発生させるためのタンパク質（SR-CALIタンパク質）の開発、SR-CALIのための超解像顕微鏡装置の開発、そして細胞中の微小領域においてSR-CALIが起こることを確認してそのコンセプトを実証することである。本研究で開発するSR-CALIタンパク質は、活性酸素種を発生可能なON状態と発生できないOFF状態の2状態をとり、これらの状態間の可逆的なスイッチングを光照射で制御（光スイッチング）可能なタンパク質である。今年度は、昨年度開発した光照射分子不活性化スクリーニング法を用いてSR-CALIタンパク質の開発を進めた。今年度試作したSR-CALIタンパク質の分子デザインは、(1)光スイッチング能の無い従来型の活性酸素種発生タンパク質（CALIタンパク質）にアミノ酸変異を導入することで光スイッチング能が付与されたSR-CALIタンパク質（1分子型SR-CALIタンパク質）、そして(2)従来の光スイッチング能を持たないCALIタンパク質に光スイッチング蛍光タンパク質を融合してフェルスター・エネルギー移動（FRET）を介して光スイッチング能が付与されたSR-CALIタンパク質（FRET型SR-CALIタンパク質）の2種類である。これらのうち1分子型SR-CALIタンパク質は作成が難しいことが分かったため、FRET型SR-CALIタンパク質の作成を進めた。FRET型SR-CALIタンパク質のFRETドナーとなる光スイッチング蛍光タンパク質の作成に成功したので、これとCALIタンパク質との融合タンパク質の試作を行っているところである。