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デキストラングルコシダーゼ基質複合体の結晶構造解析による触媒機構の解明

通过葡聚糖葡萄糖苷酶底物复合物的晶体结构分析阐明催化机制

基本信息

批准号：
07J03274
负责人：
本同宏成
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに得られた結晶構造を基に,加水分解反応に用いられると思われる水分子を予測し,その結合部位に変異を導入することで,糖転移能の改善を目指した.水分子と水素結合を形成しているアミノ酸残基を置換した9つの変異体は全て,野生型酵素よりも高い糖転移能を示した.合成及び天然基質を用いたときの糖転移及び加水分解速度をそれぞれ測定し速度論的解析を行ったところ,これら変異体は,1)アクセプタ親和力の増加2)加水分解速度の低下3)糖転移速度の増加により,野生型酵素よりも高い糖転移能を示すことが明らかとなった.また,変異体は天然基質に対しても高い転移能を示したことから,他の加水分解酵素へ同様の変異を導入し糖転移能を上げることで,新しい糖質合成法と成りうることが示された.さらに変異体の1つを結晶化し,その立体構造を決定したところ,注目した水分子を含めて触媒残基周辺の立体構造は保存されていた.このことから糖転移能が上昇した理由として次の2つが考えられる.1)注目した水分子は加水分解に使われる水分子ではないが,触媒残基と結合しているため,反応中間体の安定性に影響を与え糖転移能が上昇した2)注目した水分子は加水分解反応に用いられ,変異体では水分子を捕らえにくくなり糖転移能が上昇するが,結晶構造のような静的な構造には反映されない変異体は全て野生型より高い糖転移能を示したが,その転移速度は大きく低下していた.転移速度を落とさずに転移能を上げる変異が今後の課題である.

The results show that the structure of the crystals is based on the hydrolysis of water molecules, and the binding sites are different. Water molecules bind to water molecules, and amino acid residues are replaced by amino acid residues. Wild-type enzymes are also capable of high sugar transfer. The rate of sugar transfer and hydrolysis in synthetic and natural substrates was determined by rate-theoretic analysis. The results showed that 1) the affinity for sugar transfer increased; 2) the rate of hydrolysis decreased; 3) the rate of sugar transfer increased; and 3) the wild-type enzyme increased. In addition, a variant of natural matrix shows high migration energy, and the same variation of other hydrolytic enzymes is introduced into sugar migration energy. This shows that a new method for sugar synthesis has been successfully developed. In addition, the crystallization of allogeneic substances, the determination of the three-dimensional structure, and the preservation of the three-dimensional structure of water molecules containing catalyst residues. 1) Water molecules are decomposed by water molecules, catalyst residues are combined, and the stability of reaction intermediates is affected by the increase of sugar transfer energy. 2) Water molecules are decomposed by water molecules, and the sugar transfer energy is increased. The crystal structure of the crystal structure is different from that of the wild type. The sugar transfer energy is high and the transfer speed is low. The speed of migration is different from the speed of migration.