Combinatorial再構成系を用いたγ-secretaseの構造解析

使用组合重排系统对γ-分泌酶进行结构分析

• 批准号: 07J03573
• 负责人: 宮下 紘幸
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J03573/
• 关键词: アルツハイマー病; γ-secretase; 単粒子解析; Signal peptide peptidase

Alzheimer病の発症に深く関与する老人斑amyloid構成成分であるAβpeptideを産生するγ-secretaseの機能構造解析はその根本的治療薬の合理的開発に重要である。本研究では、電子顕微鏡を利用した単粒子解析と呼ばれる構造解析手法によって、その巨大膜蛋白質複合体γ-secretaseの全体構造を明らかにする事が目的である。本酵素は、膜蛋白質の複合体であるために、非常に非特異的な吸着が多く、収量が得る事が難しいため、極低温法での撮影には至ったものの、さらなる詳細な機構解明には、より高い精度の精製と高い解像度が必要であった。そこで、単独で機能すると想定されている、本酵素のモデル酵素となるSPPに着目し、精製、及び、負染色法による電子顕微鏡像からの単粒子解析を行い、その4量体状態の3次元構造を得た。これに対する抗体との結合像の電子顕微鏡観察から、その膜配向性を決定し、内部・側面の構造が、これまでに結晶構造解析の報告のある、類似酵素の特徴と極めて似通っており、普遍的な酵素活性化機構が想定された。また、この4量体状態は、内因性SPPの主な状態であり、活性との関連に興味が持たれた。いくつかの結果により、N末端部分が中央に集まっている可能性が考えられたため、N末端側を中心に4量体を形成し、活性に影響しているという仮説を立てた。この多量体化の機能との連関を検討するため、S2細胞における内因性Drosophila SPPに対して、SPPの基質切断活性を評価するレポーターアッセイを用いて、外因性にN末端部分を発現させた場合の、内因性活性への影響を解析した。この部分SPPは、発現量が極めて低く、蛋白質解析は十分ではないが、活性を減少させる事が再現されている。この事は、SPPが適切な4量体構造を取る事で、活性を発揮するという新たな制御機構を示唆するものである。以上の成果は、申請書に記載した内容を達成し、さらに研究が拡大したものである。

Alzheimer's disease is deeply related to the composition of amyloid, the production of Aβpeptide, the functional structure analysis of γ-secretase, and the rational development of fundamental therapeutic agents. The purpose of this study is to clarify the overall structure of the giant membrane protein complex γ-secretase by using electron microscopy for single particle analysis and structural analysis. The enzyme is a membrane protein complex, which has a very non-specific adsorption, a very high amount of absorption, a very low temperature method, a very high precision, a high resolution and a detailed mechanism. In addition, the three-dimensional structure of the four quantum states of the enzyme was obtained by electron micro-mirror analysis, purification, and negative staining. The electron microscope observation of the binding image of the antibody, the determination of the membrane alignment, the structure of the internal surface, the analysis of the crystal structure, the characteristics of the similar enzyme, and the identification of the universal enzyme activation mechanism 4. The state of the organism, the state of the intrinsic SPP, the state of the activity, and the state of the association. N-terminal part is concentrated in the center, and N-terminal part is concentrated in the center. The possibility of N-terminal part is formed, and the activity is affected. To analyze the effects of endogenous Drosophila SPP activity on the expression of N-terminal part of S2 cells. Some SPPs were found to be extremely low in protein content and activity. This is the case with SPP, which is suitable for 4-dimensional structure selection, activity development, and new control mechanisms. The above results are recorded in the application form.

项目成果

Three-dimensional structure of gamma-secretase complex reconstituted in Sf9 cells

Sf9细胞中重建的γ-分泌酶复合物的三维结构

• 发表时间: 2008
• 作者: 宮下;紘幸
• 通讯作者: 紘幸

Three-dimensional structure of the gamma-secretase complex reconstituted in Sf9 cells

Sf9细胞中重建的γ-分泌酶复合物的三维结构

• 发表时间: 2007
• 作者: 宮下;紘幸;宮下 紘幸
• 通讯作者: 宮下 紘幸

Three dimensional structure of signal peptide peptidase.

信号肽肽酶的三维结构。

• 发表时间: 2009
• 作者: Asano-Mori Y;Kanda Y;Oshima K;Kako S;Shinohara A;Nakasone H;Sato H;Watanabe T;Hosoya N;Izutsu K;Asai T;Hangaishi A;Motokura T;Chiba S;and Kurokawa M.;Miyashita H
• 通讯作者: Miyashita H

Three-dimensional Structure of the Signal Peptide Peptidase

• DOI: 10.1074/jbc.m111.260273
• 发表时间: 2011-07-22
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Miyashita, Hiroyuki;Maruyama, Yuusuke;Iwatsubo, Takeshi
• 通讯作者: Iwatsubo, Takeshi

Divergent synthesis of multifunctional molecular probes to elucidate the enzyme specificity of dipeptidic gamma-secretase inhibitors

多功能分子探针的发散合成阐明二肽γ-分泌酶抑制剂的酶特异性

• 发表时间: 2007
• 期刊: ACS Chem Biol 2
• 作者: Fuwa H;Konno Y;Takahashi Y;Sasaki M;Yokoshima S;Kan T;Fukuyama T;Natsugari H;Tomita T;Iwatsubo T
• 通讯作者: Iwatsubo T