tRNA特異的なリボヌクレアーゼの分子認識機構の解明

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(1)コリシンDは全長697アミノ酸で、C末端側がtRNA(Arg)を特異的に切断するリボヌクレアーゼドメイン(以下CRD:Carboxyl-terminal RNase Domain)である。CRDとtRNA(Arg)が結合した複合体の立体構造を明らかにし、コリシンDの反応機構を明らかにする事を目的とした。CRDと基質RNAの安定した複合体を形成させるために、tRNA切断活性を低下させたCRD変異体と、CRDに切断され難い変異型RNAを用いた。これらを用いて結晶化を行ったが、結晶は得られていない。そこで計算機を用て、CRDと基質tRNAのドッキングシミュレーションを行った。その結果、tRNAの38番目のアデニンがフリップアウトし、CRDのTrp679と相互作用する事が示された。これは今までの生化学的実験の結果と合致するものであった。これまでの結果を元にコリシンDの反応機構を推測した。(2)酵母Pichia inositovoraが生産するキラートキシンを構成するサブユニット(以下Piγとする)は、酵母Kluyveromyces lactisが生産するtRNA特異的リボヌクレアーゼzymocinのγ-subunit(以下K1γとする)と、アミノ酸レベルで約19%の相同性がある。K1γはtRNA(Glu)3を特異的に切断し、この切断にはアンチコドン1文字目の修飾塩基mcm5s2Uが重要である。PirのRNA切断活性を確かめたところ、全RNA全体をスメア状に分解する、RNA特異的リボヌクレアーゼであった。また、Piγは修飾塩基mcm5s2UがあるtRNAは切断できなかった。さらに、K1γとPiγの活性に重要なアミノ酸を探索したところ、Arg,Glu,Hisの3つのアミノ酸が保存されていた。His,Gluは触媒残基、Argは負に帯電するRNAと相互作用しやすいと考えられる。