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部位特異的変異導入によるサーモライシンの機能改変とペプチド合成への応用

通过定点诱变对嗜热菌蛋白酶进行功能修饰及其在肽合成中的应用

基本信息

批准号：
07J07098
负责人：
草野正雪
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの報告から,サーモライシン(TLN)の活性を向上させる変異はLeu144→Ser(A1),Asp150→Glu(A2),Ile168→Ala(A3)であり,熱安定性を向上させる変異はSer53→Asp(S1),Leu155→Ala(S2),Gly8→Cys/Asn60→Cys/Ser65→Pro(S3)である.これらの変異の組合わせによる活性と熱安定性への効果を調べた。その結果,活性を向上させる変異であるA1とA2を組合わせたとき活性が最も向上した[N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester(ZDFM)加水分解のkcat/kmは野生型酵素の10.5倍].一方,A1とA3を組合わせると活性が消失した。熱安定性を向上させる変異であるS1とS2を組合わせたとき熱安定性が最も向上した[80℃で熱失活の一次反応速度定数(kobs)は野生型酵素の10%].一方,S1とS3を組合わせると熱安定性が向上しなかった。さらに,A1,A2,S1を組合わせると活性と熱安定性がともに向上した(ZDFM加水分解のkcat/kmは野生型酵素の10.2倍,kobsは野生型酵素の60%).すなわち,変異の組合わせにより,活性と熱安定性がともに向上した変異型TLN(L144S/D150E/S53D)が取得された。一方,A1,A2,S1,S2,あるいはA1,A2,S2を組合わせると活性が消失した。A1とS2の組合わせは活性を消失させることが示唆された。また,TLNは加水分解の逆反応を利用して人工甘味剤アスパルテームの前駆体であるZDFMの合成に応用されてきた.活性が向上した変異型酵素によるZDFM合成反応を解析した.その結果,これらの変異型TLNは野生型酵素よりもZDFM合成反応を効率的に進めることができると考えられた。

The activity of TLN varies from Leu144 to Ser(A1),Asp150 to Glu(A2),Ile168 to Ala(A3), and the thermal stability varies from Ser53 to Asp(S1),Leu155 to Ala(S2),Gly8 to Cys/Asn60 to Cys/Ser65 to Pro(S3). The effect of different combinations of activity and thermal stability As a result, the activity of N-carbobenzoxy-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester(ZDFM) was 10.5 times higher than that of wild-type enzyme. One side,A1 and A3 combination Thermal stability is highest [80 ° C thermal inactivation rate (kobs) is 10% of wild-type enzyme]. One side,S1 S3 combination In addition,A1,A2,S1 are combined to increase the activity and thermal stability (ZDFM hydrolysis kcat/km is 10.2 times higher than wild-type enzyme,kobs is 60% higher than wild-type enzyme). Different combinations of TLN(L144S/D150E/S53D) were obtained. One side,A1,A2,S1,S2, A1,A2,S2, A1,A2, S3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A A1 and S2 are the same. In addition,TLN has been used for the synthesis of ZDFM by the use of synthetic precursors from the hydrolysis of TLN. ZDFM synthesis reaction analysis As a result, the wild-type enzyme ZDFM was synthesized in the presence of TLN.