新規の血管内皮前駆細胞活性化遺伝子導入による効率的な血管再生治療の開発

虚血性脳心血管疾患は日本人の最大の死因のひとつであるのみならず、救命できた後もその後遺症によって罹患患者のQOLを著しく低下させることが大きな問題である。そこで虚血性疾患に対する新しい治療法の開発が世界中で研究されており、VEGF, bFGFといった増殖因子の投与や骨髄・末梢血中の血管内皮前駆細胞の細胞移植が臨床応用可能となってきている。しかしながらその効果は限定的であり、より効果の高い治療法への改良が必要である。私たちは毛細血管内皮細胞に高い発現を示す新規アクチン結合蛋白を同定し、その血管内皮機能における役割を解明した。そこでこの遺伝子(GMFG)を血管内皮前駆細胞に過剰発現させてその機能を活性化し、より高い血管新生能を獲得させる研究を行った。まず始めにGMFGを発現していない血管内皮細胞株のC166にGMFGを恒常的に発現させてその内皮機能の検討を行った。GMFGの導入により、血管内皮細胞の遊走能は明らかに亢進したが、細胞増殖やアポトーシスは変化しなかった。次にヒスタミン、PMAに対する血管透過性の変化を検討した。GMFGを発現させることにより、低濃度ヒスタミン、PMA刺激後の細胞膜ラッフリングが亢進した。FITC-デキストランをトレーサーとして血管内皮透過性を調べたところ、やはり低濃度ヒスタミン、PMA刺激後の透過性が亢進していた。一方で高濃度のヒスタミン、PMA刺激後の細胞膜ラッフリングはGMFG発現により明らかに低下しており、トレーサー実験でも血管内皮透過性の有意な低下が認められた。以上よりGMFGは刺激応答アクチン重合を促進させることで血管内皮細胞遊走を亢進させ、さらに血管透過性の制御を行っていることが明らかとなった。次に、GMFGを血管内皮前駆細胞に導入するためのレトロウィルスの作成を行った。GMFGのcDNAをレトロウィルスバックボーンのプラスミドにサブクローニングした後にパッケージング細胞にトランスフェクションして上清中に分泌されたレトロウィルスを回収した。このレトロウィルスをまず培養細胞に感染させてGMFGの発現誘導を確認した。現在、ヒト末梢血より血管内皮前駆細胞を単離してGMFGをレトロウィルスを用いて遺伝子導入する準備を行っているところである。

虚血性脳心血管疾患は日本人の最大の死因のひとつであるのみならず、救命できた後もその後遺症によって罹患患者のQOLを著しく低下させることが大きな問題である。そこで虚血性疾患に対する新しい治療法の開発が世界中で研究されており、VEGF, bFGFといった増殖因子の投与や骨髄・末梢血中の血管内皮前駆細胞の細胞移植が臨床応用可能となってきている。しかしながらその効果は限定的であり、より効果の高い治療法への改良が必要である。私たちは毛細血管内皮細胞に高い発現を示す新規アクチン結合蛋白を同定し、その血管内皮機能における役割を解明した。そこでこの遺伝子(GMFG)を血管内皮前駆細胞に過剰発現させてその機能を活性化し、より高い血管新生能を獲得させる研究を行った。まず始めにGMFGを発現していない血管内皮細胞株のC166にGMFGを恒常的に発現させてその内皮機能の検討を行った。GMFGの導入により、血管内皮細胞の遊走能は明らかに亢進したが、細胞増殖やアポトーシスは変化しなかった。次にヒスタミン、PMAに対する血管透過性の変化を検討した。GMFGを発現させることにより、低濃度ヒスタミン、PMA刺激後の細胞膜ラッフリングが亢進した。FITC-デキストランをトレーサーとして血管内皮透過性を調べたところ、やはり低濃度ヒスタミン、PMA刺激後の透過性が亢進していた。一方で高濃度のヒスタミン、PMA刺激後の細胞膜ラッフリングはGMFG発現により明らかに低下しており、トレーサー実験でも血管内皮透過性の有意な低下が認められた。以上よりGMFGは刺激応答アクチン重合を促進させることで血管内皮細胞遊走を亢進させ、さらに血管透過性の制御を行っていることが明らかとなった。次に、GMFGを血管内皮前駆細胞に導入するためのレトロウィルスの作成を行った。GMFGのcDNAをレトロウィルスバックボーンのプラスミドにサブクローニングした後にパッケージング細胞にトランスフェクションして上清中に分泌されたレトロウィルスを回収した。このレトロウィルスをまず培養細胞に感染させてGMFGの発現誘導を確認した。現在、ヒト末梢血より血管内皮前駆細胞を単離してGMFGをレトロウィルスを用いて遺伝子導入する準備を行っているところである。