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ネフローゼ症候群発症に関わる糸球体上皮細胞内シグナル伝達系のプロテオミクス解析

肾病综合征发病中肾小球上皮细胞内信号转导系统的蛋白质组学分析

基本信息

批准号：
19890052
负责人：
張田豊
金额：
$ 1.97万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19890052/
关键词：
ネフローゼ症候群蛋白尿糸球体上皮細胞スリット膜 Nephrin Neph1

项目摘要

1)スリット膜蛋白質Neph1のリン酸化とその意義プロテオミクスを用いたスリット膜複合体の機能解析として、まず主要なスリット膜タンパク質であるNeph1のリン酸化を解析し、糸球体上皮細胞傷害モデルであるPAN腎症、プロタミン硫酸還流モデルにおいてそのリン酸化が亢進している事をみいだした。次に、Neph1の細胞内領域のタンパク質を精製し、in vitroでリン酸化し、それを質量分析計で解析する事によりリン酸化するチロシン残基を同定した。またリン酸化に依存して結合する蛋白質をPull down法によって解析し、Grb2,Cskという蛋白質がリン酸化Neph1に特異的に結合する事、Grb2はNeph1のY637,Y638のリン酸化によって結合する事も判明した。Neph1のY637のリン酸化を特異的に認識する抗体の作成にも成功し、実際にin vivoでこのリン酸化がおこっている事を見いだした。さらにこれらの結合がどのような機能を担っているかについて解析をすすめ、FynによるGrb2結合部位であるY637のリン酸化がFynの下流でのERKの活性化を抑制する事を見いだした。これらの事から、Grb2の病態におけるリン酸化がGrb2を介して細胞内のシグナル伝達系を修飾する可能性が示された。この結果は2008年にJ Biol.Chemに投稿した。2)Nephrinのリン酸化の機能解析同様の方法によりスリット膜を構成する主成分であるNephrinのリン酸化について解析し、Nephrinの細胞内リン酸化チロシン残基の同定、そのリン酸基に特異的に結合する蛋白質を既知のNckの他に、PLC-gamma等、新規に4つ同定した。これらの成果は糸球体上皮細胞傷害時にスリット膜蛋白質がリン酸化を介して様々な蛋白質と相互作用する事、さらに細胞内シグナル伝達に直接関与する事をしめし、スリット膜の生理的および病理的な状態でのダイナミックな構造の変化を見いだした画期的な成果となった。現在これらのリン酸化が疾患発症にどうかかわっているか、さらにその他のスリット膜蛋白質のNephrinの動的構造につき検討を進めている。

1) Functional analysis of Neph1 protein in membrane complex and its significance in the treatment of glomerular epithelial cell injury due to PAN kidney disease and sulfuric acid reflux. In addition, the intracellular domain of Neph1 was purified, acidified, and analyzed by mass spectrometry. The pull-down method for protein binding dependent on acidification was used to determine the specific binding between Grb2 and Neph1 and between Grb2 and Neph1 and Y637 and Y638. Neph1 and Y637 were successfully synthesized, and in vivo, they were successfully synthesized. The function of ERK binding in Fyn and Grb2 binding site is analyzed and acidified by Y637 and the activity of ERK downstream of Fyn is inhibited. This article shows the possibility of modification of Grb2 expression system by Grb2 expression. This result was submitted to J Biol.Chem in 2008. 2) Functional analysis of Nephrin and its derivatives. Methods for the analysis of Nephrin and its derivatives, the identification of Nephrin and its intracellular derivatives, the identification of Nephrin and its derivatives, and the identification of proteins with specific binding to Nephrin and its derivatives. These results are directly related to the physiological and pathological state of the membrane during injury to spherical epithelial cells, and to the structural changes in the membrane during protein interactions and intracellular processes The structure of Nephrin and other membrane proteins is discussed in detail.