Retinal Regeneration using iris derived retinal stem cell

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研究代表者の山本が特許を取得している固定液を用いてマウス虹彩組織を固定し、in vivoにおける免疫組織染色による詳細な調査を行った。その結果、神経幹/前駆細胞マーカーの1つであるNestin を発現している細胞が存在することを明らかとした。さらに、山本が発見し、特許出願・審査中の新しい網膜幹/前駆細胞マーカーであるp75NTR(CD271)を用いて、同様に虹彩組織の免疫組織染色を行ったところ、Nestin陽性の細胞はp75NTR陽性の細胞であることが判明した。次に従来から神経系幹細胞の培養方法として知られているNeurosphere法で虹彩組織細胞を培養したところ、Sphereを形成した細胞はNestin とp75NTRが陽性の細胞であった。しかし、虹彩由来細胞は、Neurosphere法では継代培養することができなかったため、新しいマウス虹彩組織の培養条件を検討したところ、bFGFを添加することで虹彩組織に含まれる色素顆粒の脱顆粒を誘導し、かつin vitroのシャーレ内でp75NTR 発現細胞を培養・増殖できることが分かった。さらに、マウス虹彩組織から培養した細胞(マウス虹彩由来網膜幹/前駆細胞 Mouse Iris derived Retinal Stem Cell:M-IRSC)について、p75NTRによる細胞分離を試みた。このM-IRSCから選択分離したp75NTR(+) Cellsとp75NTR(-) Cellsについて、レチノイン酸を含む網膜細胞への分化誘導培地で培養し、比較検討したところp75NTR(+) Cells から網膜細胞へ分化誘導することで、効率的にRhodopsinとRecoverin陽性の視細胞、Calbindin陽性の水平細胞、およびPKC陽性の双極細胞へ分化誘導できることをリアルタイムPCRによるm-RNAの発現定量実験、および細胞免疫染色で確認できた。