細胞増殖因子HB-EGFの分泌制御機構の解析

细胞生长因子HB-EGF分泌调控机制分析

• 批准号: 19790259
• 负责人: 麻野 四郎
• 金额: $ 2.42万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19790259/
• 关键词: 細胞増殖因子; エクトドメインシェディング; HB-EGF; ADAMプロテアーゼ; 遺伝子スクリーニング; siRNAライブラリー

HB-EGFを含むEGFファミリーの分子は全て膜結合型で産生され、細胞外ドメインがプロテアーゼによって切断されるシェディングという過程を経て初めて分泌型となるが、この過程は個体発生と腫瘍形成に重要な意味を持つことが示されている。EGFファミリーのシェディングの分子機構については、細胞内カルシウム濃度、PKCの活性化、Rasの活性化、ストレス刺激などが重要な役割を果たしていることが知られている。また、ADAM17/TACEプロテアーゼがEGFファミリーの全てのシェディングに関与していることが分かっている。しかし、種々の細胞外刺激に対応した多様なシグナルの活性化がADAM17によるEGFファミリーのシェディングへと収束する分子機構については不明である。この部分の解明を目標としてHB-EGFのシェディングに至るシグナル経路をsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングにより明らかにすることが本研究の目的である。申請者らはsiRNAライブラリーを用いて、HB-EGFシェディングに関与する分子のスクリーニングをする系を確立し、分子の同定を終了しつつある。スクリーニングの概要を以下に述べる。まず、HB-EGFをヒト子宮内膜癌由来HECI細胞に高発現したHECI-H細胞にSBI社のsiRNAレンチウイルスライブラリーを感染させ、様々な遺伝子の機能を欠損した細胞群を構築する。そして、HB-EGFのシェディングを誘導するために、HECI-H細胞にTPA刺激を与える。刺激後、トリプシン処理でHECI-H細胞を浮遊化し、HB-EGFに対する抗体を用いて細胞膜上のHB-EGFを染色する。シェディングが起こっていない細胞は細胞表面にHB-EGFの細胞外ドメインが残存しており、強いシグナルを出すと考えられる。HB-EGFシェディング能を欠いていると思われるこれらの細胞をセルソーターFACSAriaを用いて分取する。分取された細胞からRNAを回収し、siRNA周辺の塩基配列特異的なプライマーを用いて、siRNA配列を含むDNAを増幅する。SBI社のsiRNAライブラリーのsiRNAの配列はアフィメトリックス社のマイクロアレイに対応している。このため、マイクロアレイ解析により分取された細胞群で発現されていたsiRNAが容易に同定できた。また、これらのsiRNA発現ベクターをクローン化し、実際にHB-EGFのエクトドメインシェディングを阻害することも確認できた。さらに、これらのsiRNAがターゲットとする遺伝子に対する別のsiRNA発現ベクターを作製し、このsiRNAもエクトドメインシェディングを阻害することも確認し、HB-EGFのエクトドメインシェディングに関与する新規の遺伝子が同定できた。今後は、この遺伝子がADAM17/TACEプロテアーゼを活性化する分子機構の解明に向けて研究を進めていく予定である。

HB-EGF contains EGF molecules that are fully membrane-bound, extracellular, and secretory. This process is important for individual development and tumor formation. The molecular mechanism of EGF is related to the intracellular concentration of EGF, PKC activation, Ras activation, and the stimulation of EGF. The ADAM17/TACE protocol was developed for EGF and its full range of applications. In addition, the extracellular stimulation of the seed is not clear in the molecular mechanism of ADAM17. The purpose of this study is to investigate the role of HB-EGF in the development of siRNA. The applicant shall establish the molecular identity of siRNA and HB-EGF, and shall determine the molecular identity of siRNA. The following is a summary of the information. The expression of HB-EGF in endometrial cancer is highly expressed in HECI cells, and the siRNA in SBI cells is highly expressed in HECI-H cells. HECI-H cells were stimulated by TPA. After stimulation, HECI-H cells were cultured in vitro and HB-EGF antibody was used to stain HB-EGF on the cell membrane. The cell surface of HB-EGF and its extracellular membrane remain in the cell. HB-EGF can be used in cell sorting and sorting. RNA amplification in isolated cells, siRNA-specific alignment, and siRNA-containing amplification The siRNA sequence of SBI cells is very different from that of SBI cells. The siRNAs are easy to detect and isolate from cell populations. This is the first time that we've seen this siRNAs, and we've seen it in the past, and we've seen it. In addition, the siRNAs of HB-EGF are required to be produced by other siRNAs corresponding to the gene. The siRNAs are required to be produced by other siRNAs. The siRNAs are required to be produced by other siRNAs. The siRNAs are required to be produced by other siRNAs. In the future, the molecular mechanism of ADAM17/TACE will be studied and determined.