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血管内皮細胞増殖因子の遺伝子転写産物中に存在する核酸四重鎖構造の機能解析

血管内皮生长因子基因转录本中核酸四链体结构的功能分析

基本信息

批准号：
15J08633
负责人：
齊藤大希
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J08633/
关键词：
G-quadruplex グアニン四重鎖アプタマー pre-mRNA VEGF PDGF

项目摘要

本研究では、ゲノム中に存在する核酸高次構造であるG-quadruplex (G4)に着目し、新規アプタマー探索法の開発及びG4結合タンパク質とG4の生体内相互作用の解析を目的に研究を行った。これまでに標的タンパク質の遺伝子プロモーター領域中からG4構造形成可能なDNA配列を同定することによるアプタマー探索法(G4 promoter-derived aptamer selection (G4PAS))を開発している。一方で、G4構造はゲノムDNAのみでなく、pre-mRNA中にも多数存在する知見から、G4形成RNA配列においても同戦略によるアプタマーの探索を試み、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）及び血小板由来増殖因子（PDGF）に結合するアプタマーを取得することに成功した。RNAアプタマーの探索では、生体内に存在し得るG4形成RNA配列とVEGF、PDGFの相互作用をin vitroで示した。これらの因子の生理機能への関連を評価するため、抗VEGF抗体を用いた免疫沈降を試みた。本年度は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて実験条件の検討を行い、RNA沈降を確認できた。次に、免疫沈降産物を逆転写後、VEGF遺伝子特異的なプライマーを用いてPCR増幅することでVEGFタンパク質が自身の遺伝子と相互作用するかの検討を試みた。定量PCRでの評価ではVEGF遺伝子の増幅は見られなかったが、今後マイクロアレイあるいは次世代シークエンサーにより網羅的に解析することでVEGFが相互作用するG4形成領域を同定可能であると考えられる。

In this study, we aimed to explore the high-order structure of nucleic acid in the G4 complex, explore new methods for the development of G4 complexes and analyze the interaction between G4 and G4 in vivo. The G4 promoter-derived aptamer selection (G4PAS) method was developed in the field of DNA alignment identification. One side, G4 structure must be used to detect the presence of DNA, pre-mRNA, G4 RNA alignment, vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet derived growth factor (PDGF). RNA alignment and interaction between VEGF and PDGF were demonstrated in vitro. The relationship between the physiological function of VEGF and its expression was evaluated. The anti-VEGF antibody was used in the immune sedimentation test. This year, we conducted a study on the use of umbilical vein endothelial cells and RNA deposition. Secondly, after reverse transcription of immunoprecipitation products, VEGF gene-specific primers are used to increase PCR amplification, and discussions are conducted on the interaction of VEGF gene with its own gene. Quantitative PCR analysis of VEGF gene amplification in the next generation and analysis of VEGF interaction in the G4 formation domain